Процесс приготовления гистологического среза для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:
1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4) окрашивание или контрастирование срезов; 5) заключение срезов в канадский бальзам или другие прозрачные среды (только для световой микроскопии).
Фиксация — воздействие химическими или физическими агентами (формальдегид, спирт, четырехокись осмия, замораживание и др.), вызывающее процесс необратимой коагуляции белков и прекращающее процессы жизнедеятельности. Выбор способа и длительности фиксации зависит от задач исследования и особенностей объектов исследования (проницаемость тканей для различных фиксаторов неодинакова). После применения некоторых фиксаторов (формалин, сулема и др.) материал нужно промыть в воде, а затем удалить воду с помощью спиртов возрастающей крепости (от 60° до 100°).
Уплотнение (затвердение) материала производят либо путем замораживания, либо путем пропитывания специальными затвердевающими средами— парафином, целлоидином (для световой микроскопии), синтетическими смолами (для электронной микроскопии). Для лучшего проникновения этих уплотняющих веществ в клетки и ткани используются растворители (ксилол, хлороформ, эфир и др.).
Приготовление срезов (парафиновых и целлоидиновых) производят с помощью специальных приборов — микротомов, из замороженных кусочков— с помощью криотомов (в криостатах). Парафиновые, целлоидиновые и замороженные срезы имеют толщину 4-20 мкм, полутонкие—1-2 мкм, ультратонкие— 400-800 нм. Срезы толщиной 4-20 мкм готовят на санных или ротационных микротомах, полутонкие и ультратонкие — на ультрамикротомах с использованием стеклянных ножей. Для быстрого получения срезов (экспресс-гистологическая диагностика) используют замораживающий микротом и криостат.
Окрашивание срезов позволяет выявлять разнообразные микроструктуры клеток и тканей, повышать их контрастность. Микроструктуры, отличающиеся по своим физико-химическим свойствам, по-разному воспринимают красители, среди которых различают основные, кислые и нейтральные.
Основные красители — красящие соли оснований (гематоксилин, метиловый синий, толлуидиновый синий, азуры, тионин. и т. д.), связываясь с кислотными соединениями гистологических структур, вызывают их контрастирование окрашиванием в цвета синего. Структуры, воспринимающие основные красители, называют базофильными.
Кислые красители (пикриновая кислота, эозин, эритрозин, конгорот, лихтгрюн, оранж и т. д.), связываясь с основными соединениями гистологических структур, вызывают их контрастирование окрашиванием в цвета красителя (красного, желтого, оранжевого, зеленого). Интенсивность окрашивания зависит от условий фиксации и количества прореагировавшего с красителем вещества. Структуры, воспринимающие кислые красители, называют оксифильными.
Нейтральные красители содержат как основные, так и кислые красящие компоненты. Структуры, воспринимающие нейтральные красители, называют нейтрофильными.
Импрегнация — метод выявления структур клеток и тканей, основанный на различной их способности удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов (серебро, свинец, осмий, золото).
Заключение срезов позволяет длительное время сохранять препарат, его окраску, прозрачность и структуру. Обычно срезы заключают в канадский бальзам, предварительно произведя обезвоживание в спиртах возрастающей крепости. Иногда препараты заключают в водорастворимые среды (глицерин, желатин или их смесь).
В качестве примера рассмотрим последовательность операций для получения парафиновых срезов и их окраски гематоксилин-эозином.
