В клетке аминокислоты, как правило, не существуют в свободном виде. Они взаимодействуют с тРНК и сохраняются в виде аминоацил-тРНК (аа-тРНК). Биологический смысл такой мобилизации тРНК заключен в том, что аминокислоты при этом предохраняются от действия катаболических ферментов и не сгорают в клетке, а используются для синтеза белка. Лишь при избытке какой-нибудь из аминокислот часть ее остается не связанной с тРНК и через реакции переаминирования вовлекается в цикл лимонной кислоты для энергетического обмена.
Аминокислота присоединяется ковалентной аминоацильной связью между СООН-группой АК и гидроксильной группой 3′-углеродного атома рибозы к 3′-концевому аденозину ССА-триплета тРНК. Аминоацильная связь является макроэргической, поэтому ее образование можно рассматривать как активирование аминокислоты. В последующем энергия этой связи используется для образования пептидной связи.
Процесс образования аа-тРНК складывается из двух реакций. Первая представляет собой взаимодействие аминокислоты с АТР. В результате этой реакции, катализируемой аа-тРНК-синтетазой и обозначаемой как реакция первичной активации карбоксила (реакция активирования аминокислоты), образуются аминоациладенилат и пирофосфат:
Аа-тРНК-синтетаза, Mg2+
1. АК + АТР → АК ~ АМР + Н4Р2О7
Аминоациладенилат остается связанным с аа-тРНК в виде нековалентного комплекса до тех пор, пока не произойдет вторая реакция: акцептирование активированного аминокислотного остатка, или перенос его на концевую группу тРНК. Эта реакция также катализируется аа-тРНК-синтетазой:
Аа-тРНК-синтетаза
2. АК~ АМР + тРНК → АК~ тРНК + АМР
Мg2+
В результате этой реакции карбоксильная группа АК переносится на 3′-ОН группу рибозы концевого аденозина тРНК и образуется конечный продукт – аа-тРНК, а сама аа-тРНК-синтетаза и АМР высвобождаются.
Таким образом, аа-тРНК-синтетазы выполняют исключительно важную роль в реализации генетической информации. С помощью этих ферментов осуществляется специфический отбор аминокислот и «зашифровка», которая заключается в присоединении каждой аминокислоты к специальному адаптеру, способному узнавать кодон для нее на мРНК. Именно на уровне аа-тРНК-синтетаз происходит специфическая подготовка к переводу 4-буквенного генетического кода в 20-буквенный код белков. Ферментативное аминоацилирование тРНК, несомненно, выполняет кодирующую функцию.
Роль тРНК в трансляции
В белоксинтезирующей системе тРНК выполняет следующие три важные функции: а) акцепторную (с помощью специфического фермента аминоацил-тРНК-синтетазы присоединяет на одном из концов своей молекулы соответствующую аминокислоту, в результате чего возникает комплекс аминоацил-тРНК); б) транспортную (доставляет аминокислоту в форме аа-тРНК в рибосому для включения ее в растущую полипептидную цепь); в) адапторную (с помощью своего антикодона специфически взаимодействует с комплементарным ему кодоном мРНК и таким образом обеспечивает необходимую последовательность включения аминокислот в синтезируемую полипептидную цепь в соответствии с программой, заданной мРНК). Благодаря адапторной функции, тРНК «дешифрует» генетический код в РНК-матрице и переводит его в аминокислотный код белка. Реализация всех этих функций возможна благодаря уникальной структуре молекул тРНК (см. лекцию).
Аминоацил-тРНК-синтетазы
Это особый класс ферментов, катализирующих совокупность реакций, составляющих первую стадию биосинтеза белка – строго специфическое соединение аминокислоты с соответствующей ей тРНК. Для каждой АК существует специфическая аа-тРНК-синтетаза. Клетка содержит, по крайней мере, 20 типов аа-тРНК-синтетаз, обладающих специфичностью не только в отношении аминокислоты, но и тРНК. Из-за единообразия функций все тРНК имеют очень сходную пространственную структуру. Поэтому распознавание аа-тРНК-синтетазой своей тРНК должно базироваться на очень тонких различиях строения отдельных тРНК.
Аминоацил-тРНК-синтетазы имеют два активных центра: один небольших размеров, связывающий аминокислоту; и второй, протяженный, ‒ для точного выбора тРНК. АТР связывается в активном центре фермента через ион Mg2+ с имидазольным радикалом His.
Ферменты, выделенные из одной и той же клетки, но специфичные к разным АК, существенно отличаются по субъединичной структуре и молекулярной массе. Молекулярная масса большинства аа-тРНК-синтетаз составляет примерно 100 кДа, иногда 200 кДа и больше. Эти ферменты являются димерами или тетрамерами, очень редко имеют одну полипептидную цепь, содержащую до 1000 аминокислотных остатков (изолейцил-тРНК-синтетаза, аланил-тРНК-синтетаза). Структура аа-тРНК-синтетаз обеспечивает точную установку тРНК относительно фермента, в результате чего участок аа-тРНК-синтетазы, несущий активированную АК, располагается рядом с 3′-концевым аденозином.
Аминоацил-тРНК-синтетазы работают очень точно: ошибочное аминоацилирование in vivo встречается только приблизительно в одном случае из 10000 циклов этой реакции. Именно в виде аа-тРНК аминокислота непосредственно вовлекается в биосинтез белка, осуществляемый белоксинтезирующей системой клетки. Аминоацил-тРНК-синтетазы очень медленные ферменты, число их оборотов составляет 50-500 каталитических актов в минуту.
Аминоацил-тРНК-синтетазы делят на два класса: класс I (ферменты, переносящие остаток аминокислоты на 2′-ОН группу рибозы); класс II (ферменты, переносящие остаток аминокислоты на 3′-ОН группу концевой рибозы тРНК).
Аминоацил-тРНК-синтетазы существуют в виде высокомолекулярных комплексов – кодосом. Их молекулярная масса ‒ 1,4 мДа. Они включают несколько аа-тРНК-синтетаз и ферменты, модифицирующие аа-тРНК-синтетазы и регулирующие их активность. Это протеинкиназы, метилтрансферазы, фосфопротеинфосфатазы и др.
Аминоацил-тРНК-синтетазам свойственны и неканонические функции. В частности, некоторые митохондриальные аа-тРНК-синтетазы проявляют сплайсирующую активность и участвуют в процессинге мРНК. Механизм этого явления неясен.
Как осуществляется узнавание тРНК аа-тРНК-синтетазами? Элементы узнавания тРНК, по-видимому, отличаются у про- и эукариот. Это было показано в экспериментах: многие бактериальные тРНК плохо аминоацилируются аа-тРНК-синтетазами млекопитающих, и наоборот, тРНК млекопитающих служат плохими субстратами для аа-тРНК-синтетаз Е.соli.
Элементами узнавания у прокариот и дрожжей служат: а) антикодон. (главный элемент узнавания для большинства тРНК); б) Нуклеотиды акцепторного стебля; в) вариабельная шпилька (в том случае, если она достаточно длинная).
Нуклеотиды антикодона остаются основными элементами узнавания как в про-, так и в эукариотических системах. В других случаях элементами узнавания служат несколько оснований в разных участках молекулы тРНК.
Активный центр фермента высокоспецифичен в отношении субстрата, но пределы точности все же существуют. Фермент достаточно легко отличает аминокислоты с сильно различающимися свойствами, но ему трудно отличить похожие аминокислоты, например валин и изолейцин.
В случае ошибочного аденилирования изолейцил-специфический фермент гидролизует валил-АМР, в то время как изолейцил-АМР (возможно из-за гораздо больших размеров) в этот центр не входит. Благодаря этому уменьшается ошибка присоединения изолейцина до 1 на 60000. Не все аа-тРНК-синтетазы имеют такой механизм коррекции. Он нужен только для распознавания похожих аминокислот.
