Регуляция ферментативной активности

КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

 

Активирование и ингибирование ферментов

 

Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значительной степени определяется также присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые снижают её.

 

Активаторы ферментов

 

Активирующее влияние на скорость ферментативной реакции оказывают разнообразные вещества органической и неорганической природы. Так, соляная кислота активирует действие пепсина желудочного сока; желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими свободные SН-группы (глутатион, цистеин), а ряд ферментов – также витамином С. Особенно часто активаторами выступают ионы двухвалентных, реже – одновалентных металлов (см. лекцию 14). Получены доказательства того, что около четверти всех известных ферментов для проявления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов. Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза (карбоангидраза), катализирующая биосинтез и распад Н₂СО₃, практически теряет свою ферментативную активность; более того, цинк при этом не может быть заменен никаким другим металлом. Известны ферменты, действие которых активируется ионами нескольких металлов; в частности, енолаза активируется Mg²⁺, Мn²⁺, К⁺.

 

Ингибиторы ферментов

 

Ингибиторы ферментов – это вещества, вызывающие частичное (обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Ингибиторы обычно принято делить на два больших класса: обратимые и необратимые.

Исследование ингибиторов ферментов имеет важное значение. Например, при помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, может быть точно установлена не только последовательность химических реакций, но и природа участвующих в этих превращениях ферментов. Этим путем (с применением йодацетата, фторидов и других специфических ингибиторов) был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до стадии образования молочной кислоты в мышечной ткани, насчитывающий 11 стадий (с участием одиннадцати ферментов и десясти промежуточных метаболитов). Кроме того, механизм действия некоторых лекарственных препаратов состоит именно в том, что они ингибируют определённые ферменты в клетках с нарушенными функциями.

Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп, такой тип ингибирования называется необратимым. Необратимое действие ингибитора в самом простом случае может быть описано уравнением

 

E + I → EI,

где Е – фермент; I – ингибитор; EI – ферментигибиторный комплекс.

 

Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, диизопропилфторфосфата (ДФФ), а также диэтил- n -нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в cвязывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента. Так, например, ДФФ – соединение из группы нервнопаралитических отравляющих веществ – связываясь с остатком аминокислоты серина, находящимся в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы, образует фермент-ингибиторный комплекс. Этот фермент инактивирует ацетилхолин, играющий роль нейромедиатора. Одна из функций ацетилхолина заключается в передаче нервного импульса от одного нейрона к другому через синаптическую щель. Почти сразу после передачи очередного импульса ацетилхолинэстераза инактивирует ацетилхолин, расщепляя его на холин и уксусную кислоту:

 

 

Ацетилхолин				Ацетат		Холин
CH3 ô CH3 ─ N+ ─ CH3 ô СН2 ô СН2 ô О ô С ═ O ô СН3	+	Н2О	Ацетилхолин эстераза	СН3СОО	+	CH3 ô CH3 ─ N+ ─ CH3 ô СН2 ô СН2 ô ОН

 

Освободившийся нейрон готов к передаче следующего импульса. Если ацетилхолинэстераза ингибирована, то ацетилхолин накапливается, нервные импульсы следуют один за другим и мышца длительное время не расслабляется. В конце концов, наступает паралич или смерть.

Однако ДФФ обладает и полезными свойствами. На его основе был создан ряд относительно нетоксичных для людей и животных инсектицидов малатион. Сам по себе малатион неактивен и в организме высших животных разлагается на продукты, которые считаются безвредными. В организме же насекомых под действием ферментов он превращается в активный ингибитор их собственной ацетилхолинэстеразы.

Выяснилось, что ДФФ ингибирует целый класс ферментов, многие из которых способны катализировать гидролиз пептидов и эфирных связей. К этим ферментам относится не только ацетилхолинэстераза, но и трипсин, химотрипсин, эластаза, фосфоглюкомутаза и коконаза (фермент, выделяемый личинкой тутового шелкопряда и используемый ею для гидролиза шелковых нитей и освобождения из кокона). Характерная особенность всех ферментов, ингибируемых ДФФ, состоит в том, что они содержат в активном центре остаток серина, принимающий участие в каталитическом акте:

Ацетилхолин эстераза	Диизопропилфторфосфат		Диизопропилфторфосфат- ацетилхолинэстераза
E ─ СН2 ─ ОН +	CH3 ─ СН ─ CH3 ô О ô F ═ Р ═ О ô O ô CH3 ─ СН ─ CH3		CH3 ─ СН ─ CH3 ô О ô E ─ СН2 ─ О ─ Р ═ О +HF ô O ô CH3 ─ СН ─ CH3

 

Некоторые ферменты полностью ингибируются очень малыми концентрациями ионов тяжелых металлов, например ионов ртути (Hg²⁺), серебра(Ag⁺) и мышьяка (As⁺) или йодуксусной кислотой. Эти вещества необратимо соединяются с сульфгидрильными группами (-SH) и вызывают осаждение ферментного белка.

В случае обратимого действия ингибитор образует с ферментом непрочный комплекс, способный распадаться, в результате чего снова возникает активный фермент. Обратимое действие ингибитора может быть описано уравнением

 

E + I «EI, где Е – фермент; I – ингибитор; EI – комплекс.

Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 15.1).

 

 

Рис. 15.1. Действие конкурентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу): Е – фермент; S – субстрат; Р1 и Р2 – продукты реакции; I – ингибитор

 

Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой (рис.15.2). На рис. 15.2а видно, что фумаровая кислота покидает фермент, а освободившаяся молекула фермента снова готова к работе. На рис. 15,2 б показано, что малоновая кислота блокируетфермент СДГ и не позволяет ему связываться с обычным субстратом.

Сукцинатдегидрогеназа катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую. Если в среду добавить малонат (ингибитор), в результате его структурного сходства с истинным субстратом сукцинатом, проявляющейся в наличии двух таких же ионизированных карбоксильных групп, он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром и степень торможения определяется соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс.

 

а
б

 

Рис. 15.2. Конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой: а – реакция превращения янтарной кислоты в фумаровую под действием сукцинатдегидрогеназы; б – ингибирование малоновой кислотой реакции превращения янтарной кислоты в фумаровую

 

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий:

 

Неконкурентные ингибиторы по своей структуре не родственны субстрату данного фермента; в образовании комплекса с ингибитором в этом случае участвует не активный центр фермента, а какая-нибудь другая часть его молекулы. Образование комплекса влечет изменение глобулярной структуры фермента, и, хотя настоящий субстрат при этом к ферменту все же присоединяется, катализ, тем не менее, невозможен (рис. 15.3).

 

 

 

Рис. 15.3. Неконкурентное ингибирование: а – нормальная реакция; б – неконкурентное ингибирование

 

На рис. 15.3.а показано, что субстрат правильно связывается с ферментом, а ингибитор с ферментом не связывается. Активный центр фермента и сам фермент имеют нормальную конформацию. После протекания реакции освобождаются продукты реакции. На рис. 15.3.б видно, что фермент образует комплекс с ингибиторм, в результате происходит изменение конформации фермента и он утрачивает способность функционировать. Настоящий субстрат выходит из реакции в неизменном виде.

В качестве примера неконкурентного ингибитора можно привести цианид. Он связывается с ионами металлов, выполняющими у некоторых ферментов роль простетической группы (в частности, с ионами меди цитохромоксидазы), и подавляет активность этих ферментов. С повышением концентрации ингибитора скорость ферментативной реакции снижается. К моменту насыщения ингибитором она оказывается практически равной нулю.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэлиса – Ментен, Лайнуивера – Бэрка или другими и соответствующими графиками в прямолинейных координатах. При конкурентном типе ингибирования ингибитор увеличивает значение Кm, не оказывая влияния на максимальную скорость Vmах (рис. 15.4. а, б). Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется молекулами субстрата из комплекса EI.

 

Рис. 15.4. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного ингибитора: а- в координатах v от [S]; б- в координатах l/v от l/[S]; Vmах и Vi- максимальные скорости реакции; Кm и Kmi- константа Михаэлиса соответственно в отсутствие (1) и в присутствии (2) ингибитора

 

При неконкурентном ингибировании (рис.15.5. а, б) ингибитор снижает величину максимальной скорости.

Рис. 15.5. Графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии неконкурентного ингибитора: а – в координатах v от [S]; б – в координатах l/v от l/[S]; Vmах и Vi – максимальные скорости реакции; Кm и Kmi – константа Михаэлиса соответственно в отсутствие (1) и в присутствии (2) ингибитора

Если при этом величина Кm не уменьшается, говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов ЕI и (или) EIS. Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация не только о кинетике ферментативных реакций, но и о молекулярных механизмах ферментативного катализа.