Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.
Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она выражает состояние химического равновесия, достигаемого системой, и обозначается Кр. Так, для реакции
k+1
 ,
k-1
| 
|
константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентрации исходных веществ. Значение константы равновесия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (k+1) и обратной (k-1) реакций, т.е. Кp = k+1/k-1. В состоянии равновесия скорость прямой реакции: v +1 = k+1[А]·[B] равна скорости обратной реакции: v 1 = k-1 [С]·[D], т. е. v +1 = v -1 соответственно k+1[А]·[B] = k-1[С]·[D], или
.
Отсюда, 
Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе равновесия, принято называть в случае ферментативной реакции константой диссоциации фермент–субстратного комплекса, и обозначать символом KS. Так, в реакции
k+1
k-1
|  ,
|
т.е. KS равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа KS зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение KS, тем выше сродство фермента к субстрату.
При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций, не свойственную обычным химическим реакциям и связанную с явлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 14.19) ляется почти линейной и подчиняется кинетике первого порядка.
Рис. 14.19. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента: а – реакция первого порядка; б – реакция смешанного порядка; в – реакция нулевого порядка
Это означает, что скорость реакции S→Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением:
,
где [S] – молярная концентрация субстрата; –d[S]/dt – скорость убыли субстрата; k' – константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени (мин–1 или с–1).
При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна, постоянна и не зависит от концентрации субстрата. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k′′ (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента. Кроме того, различают реакции второго порядка, скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности иногда говорят о реакциях смешанного порядка (см. рис. 14.19).
Изучая явление насыщения, Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения о том, что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической реакции:
k+1 k+2
 ,
k-1
|
т.е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием промежуточного комплекса ES, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Принимая во внимание, что скорость ферментативной реакции определяется константой каталитического превращения фермент-субстратного комплекса (k+2) и его концетрации, Михаэлис и Ментен предложили уравнение, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:
где v – наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата; KS– константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л; Vmax– максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.
Из уравнения Михаэлиса–Ментен следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении KS скорость реакции является максимальной, т.е. v = Vmax (реакция нулевого порядка, см. рис. 14.19). При низкой концентрации субстрата, скорость реакции напротив, оказывается прямопропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка).
Следует указать, что уравнение Михаэлиса-Ментен в его классическом виде не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса продуктов реакции и носит несколько ограниченный характер.
| k+1 k+2
k-1 k-2
|
В связи с этим были предприняты попытки усовершенствовать уравнение, что было сделано Бриггсом и Холдейном:
,
где Кm - константа Михаэлиса, являющаяся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:
, или 
.
В числителе – константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k–1/ k+1 представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса KS. Тогда
Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше константы диссоциации фермент-субстратного комплекса KS на величину k+2/k+1.
Для определения численного значения Кm обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной Vmax, т.е. если v = 1/2 Vmaх. Подставив значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:
.
Разделив обе части уравнения на Vmах, получим:
,
откуда Km = [S]
Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной.
Определение величины Кm имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу Михаэлиса можно вычислить по графику (рис. 14.20).
Рис. 14.20. Г иперболическая зависимость начальной скорости катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата (график уравнения Михаэлиса-Ментен)
Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой Кm.
Единицы ферментов
Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности поскольку, за редким исключением ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то его количество, которое в оптимальных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата или образование одного микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин). Единицы активности фермента выражают также в наномолях (10-9моль) и пикомолях (10-12 моль).
В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль·с-1 = 60 моль·мин-l = 60·106 мкмоль·мин-l = 6·107U, или 1 U = 1 мкмоль·мин-l = 1/60) мкмоль·с-l = 1/60 ) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.
Кроме того, рекомендовано измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и зависит только от концентрации фермента.
В практике для выражения активности часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г/моль фермента). Так, одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в одну секунду 44000 молекул перекиси водорода. В то же время для того, чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад H2O2, расщепил такое число молекул H2O2, которое расщепляет каталаза в одну секунду, потребовалось бы несколько лет. Этот пример является наглядным доказательством одного из главных свойств ферментов – их высокой каталитической активности.
ЛЕКЦИЯ 15
