водой (37-38,5°С). При тяжелом и очень тяжелом течении болезни
проводится интенсивная терапия с использованием антибиотиков, при
инфекционно-токсическом шоке показаны гормоны (преднизолон,
дексаметазон) короткими курсами.
При делирии назначают бромиды, барбитураты, аминазин,
галоперидол или оксибутират натрия. Показаны анальгетики,
сердечные гликозиды, сосудистые аналептики, антикоагулянты.
Важен туалет ротовой полости (профилактика гнойного паротита),
уход, гигиена кожи (пролежни).
Постельный режим показан до 5-6 дня нормальной температуры,
далее больным разрешается вставать. Выписка должна проводиться не
ранее 12 дня нормальной температуры.
Заместитель руководителя
Департамента организации
медицинской помощи населению
А.А.КАРПЕЕВ
Начальник
Управления охраны
здоровья матери и ребенка
Д.И.ЗЕЛИНСКАЯ
Приложение N 3
к приказу
Министерства здравоохранения
Российской Федерации
от 26 ноября 1998 г. N 342
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
ЭПИДЕМИЧЕСКОГО СЫПНОГО ТИФА И
БОЛЕЗНИ БРИЛЛА (БРИЛЛА-ЦИНССЕРА)
(Методические указания)
1. Введение.
Серологические методы являются обязательным разделом
лабораторной диагностики сыпнотифозной инфекции и изучения их
эпидемиологии. Серологические реакции выполняются с применением
видоспецифических антигенов и вследствие своей высокой
специфичности имеют решающее значение для подтверждения
риккетсиозной природы заболевания.
Предлагаемые методические рекомендации составлены с целью
унификации методик исследований с учетом опыта ряда риккетсиозных
лабораторий России и зарубежных стран и в соответствии с
рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения.
Методы серологических исследований, приведенные в методических
указаниях, обеспечены коммерческими препаратами.
2. Серологические методы диагностики эпидемического сыпного
тифа и болезни Брилла (Брилла-Цинссера).
2.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).
Позволяет выявить антитела к возбудителю сыпного тифа в
ранние, начиная с 5-7-го дня болезни, что придает ей особую
ценность. В острый период болезни титры в РНГА колеблются от 1600
до 51200. В основе РНГА лежит специфическая агглютинация
эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном.
В основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) лежит
специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных
риккетсиозным антигеном или иммуноглобулинами, в присутствии
соответствующих групповых антител или антигенов.
2.1.1. РНГА с антигенным риккетсиозным эритроцитарным
диагностикумом.
РНГА с антигенным риккетсиальным эритроцитарным диагностикумом
предназначена для обнаружения и титрования специфических антител
риккетсиальной природы в исследуемых сыворотках людей.
Антигенный эритроцитарный диагностикум представляет собой
лиофильно высушенную взвесь 3% формалинизированных эритроцитов
барана, сенсибилизированных гидролизованным антигеном (гаптеном)
риккетсий.
К антигенному эритроцитарному диагностикуму прилагается
лиофильно высушенная 6% взвесь несенсибилизированных (контрольных)
формалинизированных эритроцитов барана, предназначенных для
контроля исследуемых сывороток и истощения их от неспецифических
гемагглютининов, последнее может проводиться и
неформалинизированными эритроцитами. Для разведения ингредиентов
реакции используют формалинизированный физиологический раствор
(ФФР). Последний представляет собой 0,85% раствор хлорида натрия
(рН=7.0), к которому добавлен формалин из расчета 0,3 на 100 мл
раствора хлорида натрия.
Ингредиенты реакции:
1) Исследуемая сыворотка или исследуемый антиген.
2) Антигенный риккетсиальный или иммуноглобулиновый
риккетсиальный эритроцитарный диагностикум или антигены для РНГА.
3) Формалинизированные или негативные эритроциты барана.
4) Физиологический раствор, 1% раствор нормальной кроличьей
сыворотки.
5) Формалин.
РНГА можно ставить как макрометодом в стандартных
плексигласовых планшетах с лунками, так и микрометодом - в
планшетах с лунками типа "U" микротитратора Такачи. При постановке
реакции макрометодом эритроцитарный диагностикум и контрольные
эритроциты используют в виде 1,5% взвесей. Для приготовления таких
взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят
в 2 мл, а содержимое ампулы с контрольными эритроцитами - в 4 мл
ФФР.
При постановке реакции микрометодом антигенный риккетсиальный
эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в
виде 0,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое
ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 6 мл, а с
контрольными эритроцитами - в 12 мл ФФР.
Исследуемые сыворотки перед постановкой РНГА инактивируют при
+56°С в течение 30 минут и истощают эритроцитами барана. С этой
целью вскрывают ампулу с контрольными эритроцитами, разводят ее
содержимое в 4-12 мл ФФР (в зависимости от постановки макро- и
микрометодом), после чего 5 мл полученной 1% взвеси эритроцитов
центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. и
надосадочную жидкость отсасывают. К осадку добавляют 1 мл
исследуемой сыворотки в разведении 1:10, перемешивают, выдерживают
30 минут при +37°С и центрифугируют в течение 5 минут при
2500-3000 об/мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой
истощенную сыворотку, исследуют в РНГА.
Постановка РНГА.
Вначале готовят исходное разведение исследуемой сыворотки
(1:25). С этой целью к 1 мл исследуемой сыворотки в разведении
1:10, истощенной эритроцитами барана, добавляют 1,5 мл ФФР.
Для приготовления последовательных разведений исследуемой
сыворотки в 10 лунок горизонтального ряда планшета наливают по 0,4
(0,05) мл ФФР. В первую лунку добавляют 0,04 (0,05) мл исходного
разведения (1:25) исследуемой сыворотки. После тщательного
перемешивания переносят 0,4 (0,05) мл содержимого первой лунки во
вторую, из второй переносят в третью 0,4 (0,05) мл и т.д. Из
первой лунки 0,4 (0,05) мл смеси выливают. Затем в каждую лунку
добавляют предварительно хорошо размешанного эритроцитарного
диагностикума по 0,1 (0,025) мл, планшет встряхивают и оставляют
при комнатной температуре. Учет результатов реакции - спустя
соответственно 4-5 или 2-3 часа. Постановка опыта должна
сопровождаться следующими контролями:
1. Контроль исследуемой сыворотки на отсутствие
неспецифических гемагглютининов: в лунку планшета наливают 0,2
(0,025) мл исследуемой сыворотки в исходном разведении 1:25,
добавляют 0,2 (0,025) мл ФФР и 0,1 (0,025) мл контрольных
эритроцитов.
2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие
спонтанной гемагглютинации: в 2 лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл
ФФР, добавляют по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного диагностикума.
3. Заведомо положительный контроль: постановка РНГА с
тест-сывороткой к риккетсиям Провачека, прилагаемой к данной серии
эритроцитарного диагностикума.
Учет результатов РНГА.
Учет результатов реакции проводят по наличию или отсутствию
агглютинации эритроцитов. Реакцию считают положительной (оценивают
на "+"), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки,
образуя по форме перевернутый купол с ровным или фасеточным краем.
Титром исследуемой сыворотки считают максимальное ее разведение,
которое вызывает четкую агглютинацию эритроцитарного
диагностикума.
Реакцию считают отрицательной (оценивают на "-") при оседании
эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с
четким ровным краем. В сомнительных случаях реакцию оценивают на
"+-".
2.1.2. РНГА с препаратом на основе нативных эритроцитов.
При отсутствии коммерческого антигенного риккетсиального
эритроцитарного диагностикума РНГА можно ставить с нативными
эритроцитами барана, предварительно сенсибилизированными
коммерческим антигеном (гаптеном) риккетсий для реакции
гемагглютинации. Антиген растворяют в физиологическом растворе
(рН=7,0) в соответствии с указаниями на этикетке ампулы. 4 мл
растворенного антигена смешивают с 0,1 мл осадка отмытых
эритроцитов барана, выдерживают смесь в течение 1 часа при +37°С,
встряхивая каждые 15 минут, затем центрифугируют 10 минут при
2500-3000 об/мин., надосадочную жидкость отсасывают, а осадок
суспендируют в 10 мл физиологического раствора (рН=7,0), получая
10 мл 1% взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Такой препарат
может сохраняться в течение нескольких дней при +4°С без снижения
активности. РНГА в этом случае ставят на обычном физиологическом
растворе (рН=7,0), в остальном подготовка ингредиентов, постановка
реакции и учет результатов проводятся точно также, как при
использовании сухого антигенного риккетсиального эритроцитарного
диагностикума, за исключением первого разведения исследуемой
сыворотки, которое берется не 1:25, а 1:250.
2.2. Метод флуоресцирующих антител.
Метод флуоресцирующих антител (МФА) - экспресс - метод -
сочетает высокую чувствительность люминесцентного анализа с
высокой специфичностью иммунологического метода. МФА применяется в
лабораторной диагностике с целью выявления риккетсиальных
антигенов и антител. Этот метод используют в прямой и непрямой
модификации с применением флуоресцирующих конъюгатов, полученных
на основе иммуноглобулинов специфических сывороток.
Ингредиенты и оборудование.
1. Риккетсиальные корпускулярные антигены (для МФА).
2. Специфические антириккетсиальные сыворотки.
3. Люминесцирующие специфические риккетсиальные сыворотки.
4. Люминесцирующие антивидовые сыворотки к иммуноглобулинам
человека и различного вида животных.
5. Люминесцирующие Fab-фрагменты риккетсиальных антител.
6. Забуференный физиологический раствор рН = 7,2.
7. Спирт 96°.
8. Ацетон.
9. Дистиллированная вода.
10. Бычий альбумин, меченый родамином или Эванс.
11. Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Л, ЛЮМАМ).
12. Предметные стекла.
13. Чашки Петри.
14. Емкости для промывания стекол.
15. Фильтровальная бумага.
2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.
Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с
целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и
объектах внешней среды.
Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и
обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки
исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым
спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым
карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости
от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер,
препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.
На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле
разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов
(рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом
Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба
раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле
наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с
бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при
температуре +37°С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным
дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от
избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном
растворе (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания
дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют
в люминесцентном микроскопе.
Учет результатов реакции.
Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х,
окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС
7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС
21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно
используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата
флуоресцеина).
Просматривают не менее 10-20 полей зрения. Оценку результатов
пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и
морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют
условную систему обозначения при помощи крестов:
"+++++" - яркая, сверкающая флуоресценция;
"+++" - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с
характерным для данного флуорохрома цветов (в данном случае
зеленый).
Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих
корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого
свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;
"++" - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет
люминесценции выявляется достаточно четко;
"+" - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий
различима плохо, цвет неопределенный;
"-" - флуоресценция отсутствует.
Результат считается положительным при обнаружении в некоторых
полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения
возбудителя не менее, чем на "+++" при четко отрицательном
контроле.
2.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител.
Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция
непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления
специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей
и животных.
Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим
риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления
препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения
корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят
рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации,
обечпечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных
клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном,
наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На
каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для
испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется
взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из
основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом
растворе до концентрации, обеспечивающем в каждом поле зрения
около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо
вымытое и обезжиренное наносят, по 8 капель антигена, тщательно
перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении
кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцом со
срезанным концом.
Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или
ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в
течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0
до +4°С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от
увлажнения.
Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30
минут при +56°С, готовят двукратные разведения в физиологическом
растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).
Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки
антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37°С. Затем
препарат промывают фосфатным буфером (рН=7,2-7,4) в течение 10
минут и высушивают на воздухе.
После высушивания на мазки наносят антивидовой
(соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий
гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на
этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере
30 минут при +37°С. В качестве антивидовых препаратов применяют
люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и
животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых
сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется
использование бычьего альбумина, меченого родамином, или 0,1%
раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые
смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном
объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов.
Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут
и высушивают на воздухе.
В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо
положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей
антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно
антивидовой люминесцирующей сывороткой.
Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое
обусловливает свечение риккетсий на "++", при наличии свечения на
"+++" или "++++" в предыдущем разведении.
Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение
риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей
антивидовой сывороткой в рабочем разведении.
2.3. Реакция связывания комплемента.
Реакция связывания комплемента (РСК) является универсальной,
так как дает возможность получения объективных результатов при
проведении текущей и ретроспективной диагностики. Комплемент
связывающие антитела сохраняются в сыворотке переболевших людей
десятки лет. В этой связи РСК незаменима для ретроспективной
диагностики.
РСК имеет целью определение в исследуемых сыворотках
специфических антител.
Сущность реакции заключается в связывании комплемента
комплексом антиген-антитело, что обнаруживается в присутствии
индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных
гемолитической сывороткой. При образовании специфического
комплекса антиген-антитело последний связывает комплемент,
вследствие чего после добавки гемолитической системы не возникает
гемолиза бараньих эритроцитов. Если же комплекс антиген-антитело
не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз
сенсибилизированных эритроцитов.
Таким образом, положительный результат РСК характеризуется
оседанием эритроцитов (задержкой гемолиза), а отрицательный -
феноменом гемолиза эритроцитов.
Ниже приведены две схемы постановки РСК, отличающиеся рядом
преимуществ в сравнении с ранее применявшимися в нашей стране
(Голиневич, 1962):
1) уменьшением объема использованных ингредиентов;
2) упрощением схемы титрования комплемента;
3) получением более достоверных результатов реакции за счет
титрования комплемента в присутствии антигенов (риккетсиальные
антигены могут поглощать некоторое количество комплемента, что
следует принимать во внимание и учитывать при постановке реакции).
Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген;
3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.
Обязательным условием постановки РСК является использование
точно оттитрованных компонентов. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл
(1-я схема) или 0,6 мл (2-я схема).
Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо
пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо
вымытой и высушенной в суховоздушном шкафу.
Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку.
Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном
физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида
натрия в дистиллированной воде).
Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30
минут при 56-58°С (для разрушения содержащимися в ней комплемента
и ингибиторов).
Риккетсиальные антигены растворяют в указанном на этикетке
ампулы количестве физиологического раствора, которое соответствует
рабочему разведению, определенному предприятием-изготовителем.
Сухой комплемент разводят согласно прилагаемой к этому
препарату инструкции. Гемолитическая сыворотка выпускается в
ампулах: это - сыворотка кролика, иммунизированного по
определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке
ампулы гемолитической сыворотки указан ее титр. В реакции
используют разведение гемолитической сыворотки в три раза меньше
титра, указанного на этикетке: например, титр, указанный на
этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку,
разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр
гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра
производят следующим образом. Готовят основное разведение
сыворотки 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки +9,9 мл
физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно
разливают по 0,1 мл разведений гемолитической сыворотки, начиная с
1:1000 до 1:3600, в каждую пробирку добавляют комплемент в
разведении 1:10 в объеме 0,1 мл и по 0,1 мл 3% взвеси бараньих
эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,2 мл
физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в
термостате при +30°С в течение 1 часа. По наличию полного гемолиза
эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования
гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.
Таблица 1
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
-------------------T---------------------------------------------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Разведение гемолитической сыворотки ¦
¦ опыта +------T------T------T------T------T------T------T------T------T------+
¦ ¦1:1000¦1:1200¦1:1600¦1:1800¦1:2000¦1:2400¦1:2800¦1:3000¦1:3200¦1:3600¦
+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦Гемолитическая сы-¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
¦воротка (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦3% взвесь бараньих¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
¦эритроцитов (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦Комплемент в раз-¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦
¦ведении (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦Физ. раствор (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦
+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦Оценка результатов¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦
¦опыта ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+-------
Титр гемолитической сыворотки 1:1800.
Для получения эритроцитов барана кровь, взятую из яремной
вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми
бусами путем встряхивания в течение 10-15 минут, процеживают через
стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до
+4°С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают
при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения
следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят
обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б",
выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов, или
каком-либо другом консерванте.
1-я схема постановки РСК.
Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК
предшествует титрование комплемента с целью определения его
рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена.
Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в
1 мл (таблица 2).
Таблица 2
-----------------------------T-----------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦
¦ реакции +---T---T---T---T---T---T---T---T---+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Комплемент в разведении 1:10¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Физиологический раствор (мл)¦0,9¦0,8¦0,7¦0,6¦0,5¦0,4¦0,3¦0,2¦0,1¦
L----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+----
Затем ставят опыт титрования комплемента.
Таблица 3
-----------------------------T-----------------------------------
¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦
¦ реакции +---T---T---T---T---T---T---T---T---+
¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Комплемент в различных дозах¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦
¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Антиген (мл) ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Физиологический раствор (мл)¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Гемолитическая система (мл) ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦
+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+
¦Оценка результатов ¦4+ ¦3+ ¦2+ ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
L----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+----
Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37°С на 1
час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из
равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом
растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную
предварительно в термостате в течение 30 минут) и через 30 минут
производят учет результатов.
Оценка результатов титрования комплемента заключается в
определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная
его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная
задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++);
частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и,
наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом
(+).
Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество,
которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере
эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента
принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я
доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице
комплемента при проведении связывания в термостате при +37°С в
течение 1 часа.
Постановка основного опыта.
1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно
двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока
болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К
различным разведениям их добавляют по 0,1 м: антигена и
комплемента в рабочих дозах.
К каждому опыту ставят следующие контроли:
1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в
исходном разведении + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл
комплемента в рабочей дозе);
2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл
физиологического раствора, 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе +
0,2 мл физиологического раствора);
4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического
раствора);
5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют
до ее титра;
6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют
в 2-х-3-х разведениях (1:10 - 1:40), включая так, же как и для п.
5 контроли сывороток в исходных разведениях.
После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного
встряхивания пробирки ставят в термостат при +37°С на 1 час.
2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую
по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в
