Палочковидные бактерии, извитые и нитчатые

План

Микроскопическое исследование различных форм бактерий.

16. Шаровидные:

а) кокки - Micrococcus aurantiacus, Streptococcus lactis;

б) сарцины - Sarcina ureae, Sarcina flava.

17. Палочковидные:

а) бактерии -Achromobacter stutzeri, Pseudomonas fluorescens;

б) бациллы - Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. mycoides.

18. Извитые:

а) вибрионы - Vibrio buccalis;

б) спирохеты - Spirochaeta buccalis.

Нитчатые: Crenothrix polyspora.

Материалы и оборудование

 

18. Чистые или накопительные культуры исследуемых бактерий.

19. Колонии бактерий посева из воздуха на МПА.

20. Фуксин.

21. Метиленовый синий.

22. Микроскоп.

23. Иммерсионное масло.

24. Предметные и покровные стекла,

25. Препаровальные иглы.

26. Иглы для пересева.

27. Марлевые салфетки.

28. Спиртовка или газовая горелка.

29. Штативы для предметных стекол и лотки.

Основные сведения Бактерии по своей форме делятся на четыре группы: шаровидные, палоч­ковидные, извитые и нитчатые.

Шаровидные бактерии - кокки - имеют округлые клетки. Одиночные кокки носят название монококков (или микрококков). Часто после деления та­кие клетки не расходятся, а образуют группы (рис.1). Группа из двух кокков образует диплококк. Если деление про­вис./. Micrococcus aurantiacus. исходит все время в одном направлении

и образующиеся клетки не разъединя­ются, получается нить из отдельных шариков в виде цепи; эта форма носит название стрептококка. При делении в двух взаимно перпендикулярных направлениях возникает группа, состоящая из четырех кокков, - тетракокк. Если деление происходит в трех взаимно перпендикулярных направлениях

и клетки не расходятся, то образуется скопление клеток в виде пакетов (куби­ков) - сарцины (рис. 2). Делясь в разных плоскостях и направлениях без особой закономерности, кокки образуют

беспорядочное скопление клеток,

напоминающее виноградные гроздья,

это стафилококки.

Бактерии палочковидной формы

составляют наиболее многочисленную группу (рис. 3-7). В классификации палочковидных форм те, которые могут Рис. 2. Sarcina flava. Правиль- образовывать споры, принято именовать ные пакеты по 8-16 клеток.,.

бациллами; палочковидные формы, не способные к спорообразованию, называ­ют бактериями (в узком смысле этого слова). По взаимному расположению клеток среди палочковидных бактерий различают также одиночные бактерии, диплобактерии, стрептобактерии (или ба­циллы).

В клетке бациллы обычно образуется спора. Расположение споры может быть центральным и терминальным (на конце клетки).

Некоторые бациллы, содержащие спору, не изменяют формы клетки (ба­циллярный тип спорообразования), другие при спорообразовании изменяют ее. Одни приобретают вид барабанной палочки - это так называемая плек- тридиальная форма, свойственная, например, Granulobacter pectinovorum. Другие принимают форму веретена - это клостридиальная форма, харак­терная для Clostridium pasteurianum.

Многие палочковидные бактерии подвижны. Движение обеспечива­ется жгутиками у эубактерий (рис. 3, 6), пурпурных бактерий, а также у микробов некоторых других групп в определенной стадии развития (под­вижная стадия).

Величина бактериальных клеток, как правило, очень мала и измеря­ется микрометрами (микронами). Кокки имеют размеры около 1-2 мкм в диаметре, бактерии в длину достигают в среднем 1-8 мкм, однако встре­чаются и более крупные - до 50 мкм (Beggiatoa mirabilis).

Такие микробы, как риккетсии, имеют размеры еще меньше, чем кокки (1-2 мкм в длину, 0,3-0,7 мкм - в поперечнике). А вирусы и фаги - еще мельче и видны лишь в электронный микроскоп.

Для знакомства с бактериями, которые имеют форму кокков, можно использовать перечисленные далее микроорганизмы. Micrococcus aurantia- cus (рис. 1) имеет одиночные клетки, иногда в парах и небольших цепочках.

Колонии красно-оранжевого или оранжевого цвета. Микроб усваивает минеральный азот, хорошо растет в синтетических и органических средах, расщепляет сахара. Встречается в почве, воде, воздухе. Sarcina ureae имеет клетки средних размеров (2-6 мкм). Колонии этого микроба достигают 4-5 мм в диаметре, окрашены в желтый или оранжевый цвет. S. ureae - аэроб, разлагает мочевину и белок.

 

 

 

 

Встречается в почве, в воздухе. Escherichia coli - кишечная палочка (рис. 6) имеет вид небольшой палочки (2-3 мкм), не образует спор; бактерия отно­сится к группе аммонификаторов. Вас. subtilis (сенная палочка) - аэроб, аммонификатор, спороносная короткая палочка, перитрих (рис. 3). В при­сутствии пептона и углеводов образует ацетон, уксусный альдегид, масля­ную кислоту. Bas. mesentericus - небольшая (1,5-5 мкм) спороносная па­лочка, аэроб, аммонификатор (рис. 4). Встречается на гниющих продуктах. Вас. mycoides — небольшая палочка (1,6-3,6 мкм), образующая в центре клетки овальные споры разной величины (рис. 5). На твердых питательных средах образует характерные колонии, напоминающие грибной мицелий (отсюда и название: mycoides - грибоподобный), аммонификатор, аэроб.

Извитые формы бактерий делятся на три группы: вибрионы, спи­риллы и спирохеты. Все они обладают подвижностью.

Вибрионы - не гнущиеся при движении формы; клетка пред­ставляет собой как бы часть витка спирали, по форме она слегка напоми­нает запятую (рис. 8).

 

 

Спириллы - не гнущиеся при движении формы, клетка имеет один или большее число витков спирали (рис. 9).

Способность к движению у этих бактерий обусловливается наличием жгутиков. Характер движения зависит от положения жгутиков на поверх­ности клетки.

К спириллам относится пурпурная фототрофная бактерия Rhodospirillum rubrum. Этот вид характеризуется полярным жгутиковани- ем, а также наличием в хроматофорах пурпурного пигмента родопсина и бактериохлорофиллов. Однако под микроскопом в живом состоянии оди­ночные клетки Rhodospirillum rubrum выглядят серыми и лишь в результа­те скопления большого количества бактериальных клеток культуральная жидкость бывает окрашена в пурпурный цвет (рис. 8, 9).

Спирохеты - это особая группа прокариотических одноклеточ­ных организмов. Оболочка клеток, в отличие от других бактерий, слабо ригидная, поэтому тело спирохеты способно при движении змеевидно из­гибаться.

Во внутренней структуре клеток спирохет также имеется ряд отли­чительных черт: например, наличие аксиальной цитоплазматической нити, расположенной вдоль всего тела бактерии.

Выделяют спирохеты безвредные для человека, это, например, оби­татели ротовой полости (Spirochaeta buccalis), и патогенные, которые встречаются в почве, водоемах и организмах человека и животных (Treponema pallidum).

Нитчатые бактерии. Это длинные, иногда ветвящиеся нити, вклю­чающие большое количество клеток, заключенных в трубчатое влагалище (рис. 10). Осуществляют процессы окисления соединений серы, железа, например, Beggiatoa mirabilis (ползающая бактерия), Crenothrix polyspora - железобактерия, прикрепленная к субстрату.

 

 

Ход работы

На четырех чистых предметных стеклах готовят фиксированные и окрашенные фуксином или метиленовым синим препараты культур: Вас. subtilis, Micrococcus aurantiacus, Вас. mesentericus, Sarcina flava.

Если для приготовления препаратов используют чистые культуры микроорганизмов, то следует соблюдать условия стерильности.

Фиксированные, окрашенные и промытые препараты подсушивают и рассматривают без покровного стекла с иммерсионной системой. При рас­смотрении бактерий нужно обратить внимание на форму и размеры кле­ток. Бактерии зарисовывают и подписывают их названия.

Микроскопическое исследование зубного налета. На предметное стекло наносят каплю воды, затем спичкой или зубочисткой берут немного зубного налета, смешивают с каплей воды, приготавливают мазок, фикси­руют и окрашивают фуксином. Промытый и высушенный препарат рас­сматривают с иммерсионным объективом. В препарате (рис. 8) видны раз­личные формы бактерий: Streptococus albus, Вас. maximus buccaiis и дру­гие, иногда случайные виды.

Вас. maximus buccaiis - аэроб, имеет форму длинных довольно тол­стых нитей. Дает колонии желтого, бледно-желтого или золотистого цвета.

Spirochaeta buccaiis - аэроб, клетки имеют вид длинных, довольно крупных спирально закрученных нитей.

Spirochaeta dentium - также спирально закрученная нить, однако бо­лее тонкая, чем S. buccaiis.

 

 

Vibrio buccalis - мелкие клетки полулунной формы, монотрих, как и все предыдущие виды, представитель нормальной микрофлоры ротовой полости.

Микроскопическое исследование навозного настоя. На предметное стекло наносят каплю навозного настоя, накрывают стеклом и рассматри­вают в живом состоянии при большом увеличении микроскопа с прикры­той диафрагмой (рис. 9). В препарате виды различные формы бактерий (вибрионы, спириллы, спирохеты). Движение бактерий отчетливо видно при рассмотрении их в висячей капле.

Микроскопическое исследование Crenothrix polyspora. На предметное стекло наносят каплю культуральной жидкости Crenothrix polyspora, на­крывают покровным стеклом и рассматривают при большом увеличении (рис. 10).

Контрольные вопросы

1. На какие четыре основные группы делят бактерии по их форме?

2. Как отличить сарцины от стафилококков по их внешнему виду?

3. В чем различие между бактериями (в узком смысле) и бациллами?

4. Как отличить клостридиальную форму бацилл от плектридиальной?

5. Опишите характерные особенности извитых форм бактерий (виб­рионов, спирилл, спирохет).

6. Какие микроорганизмы вы обнаружили в зубном налете?

Занятие 3. Запасные клеточные включения. Споры План

1. Обнаружение запасных клеточных включений:

а) волютина - в клетках Saccharomyces cerevisiae;

б) гранулезы - в клетках Closridium amylobacter;

в) гликогена - в клетках Вас. mesentericus, Вас. mycoides;

г) жира - в клетках Saccharomyces cerevisiae, Azotobacter chroococcum.

2. Окраска спор по методу Циля или Пешкова у Вас. subtilis, Clostridium pasteuriabum.

Материалы и оборудование

1. Чистые культуры: Вас. subtilis, Вас. mycoides, Clostridium amylo­bacter, Clostridium pasteurianum, Azotobacter chroococcum, Sac­charomyces cerevisiae.

2. Растворы Люголя для окраски гранулезы и гликогена (0,3% и 7 % р-ры 1₂).

 

3. Раствор краски судан III.

4. 5-процентный раствор хромовой кислоты.

5. 0,5-процентный раствор нейтрального красного.

6. Карболовый фуксин Циля.

7. 5-процентный и 1-процентный растворы серной кислоты.

8. Метиленовый синий.

9. Иммерсионное масло.

10. Микроскопы.

11. Покровные и предметные стекла.

12. Иглы и петли для пересева.

13. Препаровальные иглы.

14. Стеклянные палочки.

15. Спиртовка или газовая горелка.

16. Фильтровальная бумага.

17. Штативы для предметных стекол.

18. Лотки.

Основные сведения

В результате жизнедеятельности в клетках микроорганизмов обра­зуются запасные включения. Сюда относятся волютин, гранулеза, глико­ген, жир и другие соединения.

Волютин - запасное вещество, состоящее из неорганических ве­ществ (полифосфатов и полиметафосфатов) и соединений, близких к нук­леиновым кислотам. Откладывается в виде гранул у бактерий в цитоплаз­ме клеток, а у дрожжей - в вакуолях. Эти гранулы являются резервом фос­фатов, за счет которых в клетках синтезируются молекулы нуклеиновых кислот, АДФ и АТФ. Волютин накапливается при выращивании бактерий в условиях хорошего питания (на глицерине с добавлением солей фосфор­ной кислоты). Метиленовый синий окрашивает волютин в фиолетово­красный цвет. Поэтому существует другое название волютина - метахро- матические гранулы (метахромазия - свойство окрашиваться в цвет, от­личный от цвета окрашивающего вещества).

Гранулеза - крахмалоподобное вещество, которое при гидролизе да­ет D-глюкозу. Гранулеза хорошо обнаруживается у маслянокислых бакте­рий, например, у Clostridium pasteurianum.

Клетки бывают почти целиком заполнены мелкими гранулами этого вещества. Эта бактерия образует споры клостридиальной формы. В про­цессе жизнедеятельности осуществляет маслянокислое брожение, фикси­рует молекулярный азот.

Гликоген - крахмалоподобное вещество, имеет зернистую структуру, иногда же находится в протоплазме клетки в растворенном состоянии. Гликоген широко распространен у различных микроорганизмов: Saccharamyces cerevisiae (дрожжей), Вас. subtilis (сенной палочки) Вас. my­coides, Вас. mesentericus.

 

Жир как включение встречается в клетках многих микроорганизмов, его можно обнаружить в старых культурах дрожжей Saccharamyces cerevisiae.

Споры бактерий образуются при неблагоприятных условиях. Они возникают внутри бактериальной клетки и обычно имеют сферическую или овальную форму. Спора окружена толстой оболочкой, которая предо­храняет ее содержимое от высыхания. Оболочка устойчива к действию большинства химических веществ, поэтому плохо окрашивается. Чтобы споры прокрасились, требуется специальная обработка препарата. Его об­рабатывают (протравливают) кислотой, затем красят концентрированным раствором красителя при высокой температуре. При этом оболочки спор так прочно адсорбируют краску, что не обесцвечиваются при последую­щей обработке слабым раствором кислоты.

Таким образом, окраска спор производится по следующему принци­пу: протравливают фиксированный препарат кислотой, затем сильно про­крашивают его, вновь обрабатывают кислотой, обесцвечивая вегетативные тела бактерий и оставляя окрашенными споры, и, наконец, окрашивают ве­гетативные клетки в дополнительный контрастный цвет.

Ход работы

Обнаружение включений. Для обнаружения волютинана предметное стекло в каплю воды добавляют исследуемые микроорганизмы Saccharamyces cerevisiae, делают мазок, фиксируют его и окрашивают ме­тиленовым синим. Волютиновые зерна приобретают фиолетовый или фио­летово-красный цвет, а протоплазма клеток окрашивается в голубой (рис. 11).

Для обнаружения гранулезына предметное стекло нано­сят взвесь бактерий Clostridium amylobacter и смешивают с каплей слабого раствора йода. Гранулеза в бактериальных клетках окрашивается йодом в темно-синий цвет.

 

Для обнаружения гликогена пользуются более концен­трированным раствором йода. На предметное стекло наносят взвесь бакте­рий Вас. subtilis или другого микроорганизма и смешивают эту каплю с раствором йода. Гликоген окрашивается в красно-бурый цвет (рис. 12).

Для обнаружения жира в приготовленную на предметном стекле каплю суспензии исследуемых микроорганизмов Azotobacter chroococcum или Saccharamyces cerevisiae наносят каплю Судана III. Про­топлазма клетки остается бесцветной, капли жира окрашиваются в оран­жево-красный, а жиропробные вещества - в желтый цвет.

Окраска спор по методу Циля-Нильсона в модификации Мюллера. Мазок из культуры Вас. subtilis, Clostridium pasteurianum, Вас. putrificus или другой спороносной бактерии подсушивают на предметном стекле, фиксируют и наносят на него 5-процентный раствор хромовой (или сер­ной) кислоты в качестве протравы. Препарат подогревают пять минут (до появления паров), затем сливают кислоту. После этого мазок промывают водой, покрывают фильтровальной бумагой и наносят на бумагу карболо­вый фуксин Циля (окраска через фильтровальную бумагу). Красят препа­рат в течение семи минут, периодически добавляя раствор красителя и по­догревая его до появления пара или даже доводя до кипения/ По мере ис­парения растворителя добавляют краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания. Затем снимают фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и обесцвечивают (в течение 15 сек.) 1-процентным рас­твором серной кислоты (быстро погружают в стаканчик или в ванночку с кислотой или наносят кислоту на препарат), после чего промывают водой. Потом окрашивают препарат метиленовым синим в течение 1 мин. (окра­шиваются вегетативные клетки, обесцвеченные от фуксина кислотой). За­тем препарат тщательно промывают водой, подсушивают и рассматривают с иммерсией. _v

Споры окрашиваются фуксином в ярко-красный цвет, а вегетативные клетки метиленовым синим - в синий.

Окраска спор по методу Пешкова. На предметном стекле готовят мазок из культуры бацилл, высушивают и фиксируют его в пламени горел­ки. На мазок наливают раствор метиленового синего и, подогревая стекло, доводят его до кипения. Прогревают препарат 20 сек., затем промывают водой и докрашивают мазок 0,5-процентным раствором нейтрального красного или эозином в течение 30 сек. Снова промывают препарат, высу­шивают и рассматривают с иммерсионной системой. При этом бактери­альная клетка окрашивается в красный цвет, а спора - в синий.

К отчету о выполненной работе прилагаются зарисовки всех рас­смотренных препаратов.

Контрольные вопросы

1. Какие запасные включения можно обнаружить в клетках микроор­ганизмов?

2. Как формируются в клетках бацилл споры, каково их строение и биологическое значение?

3. Опишите методы окрашивания спор в клетках микробов.

Занятие 4. Методы дифференцированной окраски клеток бактерий. Обнаружение капсул

План

1. Окраска бактерий по Граму.

2. Обнаружение капсул у Azotobacter chroococcum и их окраска.

Материалы и оборудование

1. Чистые культуры Вас. subtilis, Вас. mycoides, Sacchromyces cerevisiae, Nitrozomonas sp., Chromobacter denitrificans и других микроорганизмов.

2. Свежеразбавленный раствор карболового фуксина Циля (1:10).

3. Карболовый генциановый фиолетовый.

4. 96-процентный этиловый спирт.

5. Иммерсионное масло.

6. Разбавленная тушь (1 часть туши и 10 частей воды) или раствор нигрозина.

7. Микроскоп.

8. Предметные и покровные стекла.

9. Иглы и петли для пересева.

10. Препаровальные иглы.

11. Стеклянные палочки.

12. Фильтровальная бумага.

13. Спиртовка или газовая горелка.

14. Штатив для предметных стекол.

15. Лотки.

Основные сведения

Окраска бактерий по Граму. Способ окраски по Г раму является не­обходимым диагностическим методом в микробиологической практике. Сущность дифференцированной окраски по Граму состоит в том, что краски трифенилметанового ряда, например, генциановый фиолетовый и йод образуют в клетках некоторых бактерий окрашенные соединения, ко­торые не обесцвечиваются при последующей обработке препарата спиртом и сохраняют сине-фиолетовую окраску (грамположительные). Другие бак­терии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются (грамотрицательные).

 

 

Это настолько универсальный способ сложной окраски, что все бак­терии по этому показателю делятся на две группы: красящиеся по Граму - грамположительные (грампозитивные) - и не красящиеся - грамотрица- тельные (грамнегативные). Отношение к окраске по Граму служит одним из основных морфологических признаков бактерий в их характеристике.

Способность бактериальных клеток окрашиваться по Граму зависит главным образом от химического состава и структуры клеточных стенок. У грамположительньгх бактерий клеточная стенка состоит в основном из муреина (до 95 %) и тейхоевой кислоты. В состав клеточной стенки гра- мотрицательных бактерий входят липопротеиды, липополисахариды, фос­фолипиды и незначительное количество муреина (5 %). Отношение мик­роорганизмов к окрашиванию по Граму лучше проявляется у бактерий в молодых 2-3-дневных культурах.

Капсулы бактерий. Многие микроорганизмы, в том числе и бакте­рии, выделяют большое количество слизистых веществ. Впитывая в себя воду, эти вещества набухают и превращаются в клейкую студенистую мас­су, которая образует вокруг клеток слизистые чехлы, получившие название капсул. Химический состав капсулы у разных видов бактерий различен. Обычно капсулы состоят из полисахаридов (Micrococcus aurantiacus, Leuconostoc mesenteroides). Иногда капсулы содержат гликопротеиды и полипептиды (Azotobacter chroococcum).

Образование капсул зависит от условий культуры и от особенностей питания бактерий. К числу микроорганизмов, образующих капсулы, отно­сят вышеназванные организмы, а также некоторые патогенные бактерии (например, пневмококк, палочку сибирской язвы и др.).

О наличии капсул можно судить по характерному расположению клеток, так как в этом случае клетки, окруженные капсулами, не соприка­саются друг с другом.

Для выявления капсул применяют метод микроскопирования бактерий в капле туши или нигрозина. Преимущество этого метода состоит в том, что во влажной среде можно рассматривать бактерии в живом состоянии.

Можно также рассматривать в капле тунп предварительно окрашенные бактерии (негатив ная окраска по Омелянскому).

Ход работы

Окраска по Граму. На одном предметном стекле поочередно готовят и фиксируют три мазка (рис. 13). В центре - мазок исследуемого микроор­ганизма, а справа и слева - контрольных: Nitrozomonas sp. (грамотрица- тельный) и Вас. mycoides (грамположительный). На фиксированные мазки кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят сверху краситель (ген- циановый фиолетовый). Через 1-2 мин. снимают бумажку и, не промывая мазок водой, наносят на препарат раствор йода (мазок чернеет).

 

Через 1 мин. действуют на мазок 96-процентным спиртом: наливают спирт на предметное стекло или погружают стекло в спирт на 1 мин., затем про­мывают препарат водой. После промывания дополнительно окрашивают мазок раствором фуксина, через 0,5 мин. препарат промывают водой и вы­сушивают над спиртовкой.

Готовый препарат исследуют под микроскопом с иммерсионной сис­темой. Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в розовый.

Почти все патогенные кокки являются грамположительными, среди палочковидных бактерий встречаются как грамположительные, так и грам­отрицательные. Большинство спорогенных бацилл окрашиваются по Гра­му положительно.

Обнаружение капсул. Для обнаружения капсул из чистой культуры Azotobacter chroococcum или Вас. megaterium готовят суспензию. Каплю суспензии помещают на предметное стекло, смешивают с каплей черной туши, покрывают покровным стеклом и рассматривают с иммерсионным объективом. На темном фоне препарата отчетливо видны неокрашенные крупные клетки Azotobacter chroococcum, а также заметна граница между капсулой и клеткой бактерий (рис. 14).

Для получения негативной окраски капсул по Омелянскому каплю суспензии Azotobacter chroococcum сна­чала смешивают на предметном стекле с каплей раствора краски (карболового фуксина или генцианового фиолето­вого), выдерживают 2-3 мин., затем прибавляют каплю туши, снова хорошо размешивают, размазывают по стеклу и высушивают на воздухе.

Вместо туши можно использовать 10-процентный раствор нигрозина, ко­торый окрашивает общий фон в черный цвет.

Препарат рассматривают с им­мерсией. В поле зрения микроскопа на черном фоне отчетливо видны ок­рашенные в розовый или фиолетовый цвет клетки бактерий, вокруг кото­рых видны светлые неокрашенные капсулы в виде различной величины ободков.

К отчету о выполненной работе должны быть приложены рисунки полученных препаратов, описания микроорганизмов и методики окраши­вания.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается сущность метода окраски по Г раму?

2. Каковы различия в химическом составе и структуре клеточных стенок у грам положительных и грамотрицательных бактерий?

3. Из каких веществ состоят капсулы бактериальных клеток?

4. Каковы методы обнаружения капсул?

 

 

Тема 3. АНАЛИЗ МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА, ВОДЫ И ПОЧВЫ

Занятие 5: Микробиологический анализ сред: воздуха - методом осаждения, воды и почвы - методом разбавления

План

1. Подсчет колоний микроорганизмов в чашках Петри с посевом из воздуха.

2. Учет численности микроорганизмов на агаровых пластинках с посевом из воды или почвы при разных разбавлениях.

3. Микроскопическое изучение микробов воды, почвы и воздуха.

4. Пересев микроорганизмов для получения чистых культур.

Материалы и оборудование

1. Чашки Петри с посеянными на предыдущем занятии культурами микробов из воздуха, воды и почвы.

2. Пробирки с питательной стерильной средой для пересева.

3. Микроскопы.

4. Предметные и покровные стекла.

5. Иглы и петли для пересева.

6. Ручной бокс для пересева.

7. Спиртовка.

8. Метиленовый синий.

9. Фуксин.

10. Иммерсионное масло.

11. Штатив для предметных стекол.

12. Лотки.

13. Карандаш по стеклу.

14. Ручные лупы.

15. Колбы на 100мл.

16. Пробирки.

Основные сведения Итоги опытов по учету микрофлоры воздуха, воды или почвы с по­севами на питательные среды подводятся через 6-7 дней после их зало­жения. Все это время чашки Петри или пробирки с посевами должны на­ходиться в термостате при температуре, указанной для данного опыта.

Колонии рассматривают через стекло, не открывая чашку Петри. Ес­ли колоний немного, их считают на всей поверхности агар-агара чашки Петри. При большом количестве колоний чашку Петри кладут на лист черной бумаги, разделенный на 4 - 6 секторов, и считают количество ко­лоний в каждом секторе. При подсчете и рассмотрении колоний рекомен­дуется использовать лупы.

Описание колоний микробов, выросших на питательной среде, про­водят по следующим показателям: форма (округлая, неправильная); по­верхность (гладкая, блестящая, шероховатая, сухая, складчатая); край (ровный, волнистый, городчатый); цвет; размер (диаметр).

Следует отметить, что метод подсчета колоний в чашках Петри с по­севом из воздуха дает лишь приблизительные данные. Учитываются лишь микробы быстро оседающей пыли, кроме того, на твердой поверхности агар-агара прорастут только аэробные и факультативно анаэробные формы микроорганизмов. Надо учесть еще и то, что мясопептонные агаровые пла­стинки не являются универсальной питательной средой для микроорга­низмов, на ней прорастут лишь отдельные виды микробов. Считают, что этим методом определяется от 30 до 60% микроорганизмов и спор, содер­жащихся в воздухе.

Более точный количественный учет микрофлоры воздуха, особен­но в закрытых помещениях, производится с применением специальных приборов.

Для изучения морфологии и физиологии микроорганизмов исполь­зуют чистые культуры. Существуют различные методы получения чис­тых культур микроорганизмов. Чистая культура может быть получена из отдельной колонии или одной клетки. Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов до настоящего времени является ме­тод, предложенный Р. Кохом. Чистую культуру получают из одной бак­териальной клетки, из которой (предположительно) развивается одна колония. При этом производят многократные пересевы бактерий из от­дельных колоний или накопительных (элективных) культур на пита­тельные стерильные среды.

Аэробные микроорганизмы могут расти на поверхности плотных пи­тательных сред, а также жидких - при постоянной аэрации или встряхива­нии питательной среды (глубинный способ выращивания).

Анаэробные бактерии культивируют без доступа кислорода. Их вы­ращивают под большим слоем жидкой питательной среды или в плотной толще.

Ход работы

Питательную среду, подготовленную и простерилизованную на пре­дыдущем занятии, надо перенести в стерильные чашки Петри. Стерильный питательный мясопептонный агар (МПА) расплавляют, погрузив пробирки на 20-25 мин. в водяную баню с горячей водой. Двумя пальцами левой ру­ки (средним и указательным) вынимают из пробирки пробку, большим пальцем и мизинцем этой же руки приподнимают крышку заранее подго­товленной стерильной чашки Петри так, чтобы в щель между крышкой и чашкой могла пройти верхняя часть пробирки, быстро выливают расплав­ленный агар-агар и закрывают чашку Петри. Слегка покачивая чашку, рас­пределяют среду равномерно по ее дну и оставляют стоять на ровной по­верхности.

Когда агар-агар полностью остынет и затвердеет, производят посев микроорганизмов и спор из воздуха. Для этого приготовленные чашки Петри (2-3) размещают в разных местах исследуемых помещений и на 5 мин открывают крышки. При этом микроорганизмы и споры, содержащие­ся в воздухе, постепенно осажда­ются на открытой поверхности агар-агара. Крышки закрывают, на торцовой их части восковым карандашом отмечают, кто и где производил посев.

Чашки Петри заворачивают в бумагу и помещают в термостат на 7 дней при температуре 23- 26°С. В термостате чашки Петри держат крышками вниз, чтобы конденсирующаяся влага не смачивала посева (рис. 15).

Можно поставить следую­щий опыт: произвести посев из воздуха в одних и тех же условиях в четыре чашки Петри; одну из них оставить для контроля, в другую влить

30. мл. раствора пенициллина или другого антибиотика, в третью положить немного растертого лука или чеснока (фитонциды), а четвертую в раскры­том виде подвергнуть облучению ультрафиолетовыми лучами под кварце­вой лампой (расстояние от лампы - 20-30 см, время облучения - 20 мин.). Под действием ультрафиолетовых лучей гибнут микроорганизмы, но не их споры.

На питательный агар-агар в чашках Петри после посева из воздуха можно разложить диски из фильтровальной бумаги, пропитанной раство­ром каких-либо антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и пр.). Рас­стояние между дисками должно быть 2-3 см, в этом случае можно выявить действие различных антибиотиков на микроорганизмы.

Выращивание колоний микроорганизмов почвы на твердых пита­тельных средах методом разбавления. Сущность метода заключается в нанесении почвенной суспензии с микроорганизмами на поверхность твердой питательной среды. Учет количества микроорганизмов проводят по числу развивающихся колоний, предполагая, что одна микробная клет­ка дает начало одной колонии.

Готовят твердую стерильную питательную среду из МПА в чашках Петри. Берут 10 г почвы, вносят в колбу с 90 мл стерильной воды, хорошо встряхивают, получают первое разбавление 0,1. Взяв из первой колбы 1 мл в пробирку с 9 мл воды, получают разбавление 0,01, так можно получить несколько разбавлений до 0,000001. Из каждого разбавления, тщательно взболтав, берут по 0,1 мл жидкости и выливают в отдельные чашки Петри (рис. 16). На боковой стенке чашки Петри отмечают степень разбавления. Все чашки ставят в термостат сначала при температуре 30°С, а затем при 20-23°С на 3-5 дней. Выросшие колонии анализируют и при необходи­мости определяют микроорганизмы до рода или вида (рис. 17).

 

 

 

Выращивание микроорганизмов почвы методом обрастания стекол по Н.Г. Холодному. Чтобы вырастить микроорганизмы почвы по методу

Н.Г. Холодного, в исследуемую почву закапывают стерильные предметные стекла и оставляют их на несколько недель. Вскоре поверхность стекол покрывается тонким слоем почвенного раствора, на нем и поселяются микроорганизмы. На поверхности стекол формируются характерные для данной почвы микропейзажи.

Стекла можно закопать в почву в природных условиях, в цветочных горшках или сосудах с почвой. Для этого в почве ножом делают глубокий вертикальный разрез, в который опускают стекло, оно должно быть погру­жено в почву на 3-5 см ниже поверхности. Почву систематически поливают.

Выращивание микроорганизмов воды. Берут питательную среду МПА в чашках Петри и воду из различных водоемов: речки, колодца, бо­лота, лужи, - а также водопроводную, кипяченую.

31. 5 мл воды выливают на питательную среду в чашке Петри, закры­вают крышку, осторожно покачивая чашку, распределяют воду по поверх­ности питательной среды. Чашку надписывают и ставят на проращивание.

Учет численности бактерий в воде или почве методом питательных пластин (метод Коха). Сначала готовят суспензию почвы или пробу воды методом разбавления. Подго­товленные стерильные колбы и пробирки с водой нумеруют по порядку и ведут постепенное разбавление почвенной суспензии и воды по следую­щей схеме: 1мл исследуемой воды или 1 г почвы переносят в колбу №1 (99 мл стерильной воды), получают первое разбавление до 0,01. Содержимое колбы взбалтывают, стерильной пипеткой отбирают по 1мл в пробирку №1 (9мл стерильной воды),получают разбавление 0,001, и в колбу №2 (99мл воды) - разбавление 0,0001. Из колбы №2 отбирают по 1 мл в пробирку №2 и колбу №3, получая последние разбавления - 0,00001 и 0,000001 соответ­ственно. Каждый отбор проводят стерильной пипеткой.

После тщательного взбалтывания содержимого всех сосудов берут из каждого по 0,1мл. жидкости и выливают в чашки Петри на теплый сте­рильный МПА. Чашки маркируют и ставят в термостат сначала при темпе­ратуре 30°С, а затем при 20 — 23°С на 7 дней. Через 48 часов проводят предварительный, а через 7 дней окончательный подсчет числа выросших колоний.

Иногда может оказаться так много колоний, что они сливаются меж­ду собой, особенно в первых разведениях, а в последних - единичные. По­этому при подсчете цифры могут сильно отклоняться и результат будет недостоверным. Для правильного учета подсчитывают только чашки, в ко­торых колоний больше 10, но не более 200.Чашки просматривают в прохо­дящем свете и отмечают подсчитанные колонии тушью, чтобы не считать дважды. Для подсчета большого числа колоний (более 200) используют счетную камеру Вольфлюгеля. Перевернутую чашку помещают на под­ставку камеры и накрывают стеклянной пластиной с нанесенными на нее квадратными сантиметрами. Число колоний подсчитывают в 20 - 25 квадратах в разных местах чашки, выводят среднее арифметическое и пересчи­тывают на всю площадь чашки.

Пример расчета: в чашке Петри №5 с разбавлением 1:1000000 вы­росло 6 колоний. Из одной микробной клетки или споры вырастает одна колония. Количество микробов (А) в 1г почвы или в 1мл воды рассчитыва­ется по формуле:

где 1мл - количество суспензии, вылитой в одну чашку Петри при закладке опыта.

На основании полученного результата делают выводы о степени за­грязненности воды или о насыщенности почвы микроорганизмами.

Подсчет количества колоний в чашке Петри при прямом посеве из воздуха. Рассматривают в чашках Петри колонии: ориентировочно определяют, к какой группе микроорга­низмов относится та или иная из них, описывают наиболее интересные группы колоний (их форму, цвет, очертания краев, поверхность и т.д.).

Подсчитывают число колоний в чашках Петри и рассчитывают ко­личество микробов в Юл воздуха. По приблизительным подсчетам (Оме- лянский), на площади в 100см² в течение 5мин. оседает столько микроор­ганизмов и спор, сколько их содержится в Юл воздуха. Допускаем, как и в предыдущих расчетах, что каждая колония вырастает из одной клетки или споры.

Пример расчета: в чашках Петри обнаружено в среднем по 15 коло­ний; радиус чашки Петри - 5 см, площадь - 3,14 • 25см² = 78,5см².

Количество микроорганизмов или спор (А) в 10 л воздуха рассчиты­вается так:

Произведя расчеты, выясняют различия в количественном составе микрофлоры тех помещений, где производился посев из воздуха. Устанав­ливают влияние антибиотиков и ультрафиолетовых лучей на микроорга­низмы.

Если ставились опыты с антибиотиками, фитонцидами или ультра­фиолетовым облучением, делаются выводы о том, как влияют на рост ко­лоний указанные факторы.

Микроскопическое исследование микроорга­низмов из наиболее интересных колоний, вырос­ших в чашках Петри. Приготавливают фиксированные и окра­шенные препараты и рассматривают их с иммерсионным объективом. Оп­ределяют, к какой группе относятся обнаруженные микроорганизмы (кок­ки, палочки, сарцины, дрожжи, грибы), устанавливают, как они красятся по Г раму.

 

Пересев микроорганизмов на стерильные пита­тельные среды для получение чистых культур. Пере­сев производится в непосредственной близости от горящей горелки, лучше в специальных микробиологических камерах или боксах, чтобы сохранить чистую культуру. Заранее разогревают на водяной бане несколько проби­рок со стерильной питательной средой до полного расплавления агар- агара. Укладывают пробирки на столе в наклонном положении для того, чтобы после застывания агар-агара получить косую поверхность. Когда среда застынет, производят посев микроорганизмов стерильными микро­биологическими иглами и петлями; на косую поверхность агар-агара де­лают посев штрихом с помощью петли, на прямую поверхность - уколом иглы.

Для посева штрихом готовят пробирки с косой поверхностью агар- агара. Чашку Петри, из которой будут производить посев бактерий, ставят слева, иглу берут в правую руку. В левую руку между указательным и средним пальцами, так, чтобы скошенная поверхность агар-агара была хо­рошо видна, помещают пробирку, а большим и безымянным пальцами этой руки придерживают крышку чашки Петри; петлю прокаливают в пламени горелки. Левой рукой (большим и безымянным пальцами) при­поднимают крышку чашки Петри и петлей прикасаются к поверхности ко­лонии. Безымянным пальцем и мизинцем правой руки вынимают пробку из пробирки и, не выпуская пробки из руки, петлей с кусочком культуры осторожно проводят по поверхности агар-агара в пробирке. Вынимают петлю, стерилизуют ватную пробку в пламени горелки, закрывают про­бирку и вновь стерилизуют петлю.

Для посева уколом готовят пробирки с прямой поверхностью агар- агара и иглу. Всю операцию повторяют так же, как и в первом случае, только иглу после прокалывания и захвата пересеваемой колонии микро­бов вводят в глубь питательной среды, насколько позволяет длина ее ме­таллической части.

После посева в течение 7 дней пробирки выдерживают в термостате при температуре 25-30 °С, в дальнейшем чистые культуры микроорганиз­мов в пробирках хранят при температуре 2-4°С в холодильнике.

Колонии, выросшие в пробирках, через неделю после посева рас­сматривают и делают вывод о чистоте посева. Устанавливают, принадле­жат ли они к аэробным, анаэробным или факультативно-анаэробным мик­роорганизмам. В первом случае колонии разовьются только на поверхно­сти, во втором - только в глубине агар-агара, в третьем - по всей поверх­ности укола в агар-агар.

Отчет о проделанной работе должен состоять из ее описания и зарисо­вок колоний, выросших в чашках Петри и после пересева.

Контрольные вопросы

1. Как произвести анализ микрофлоры методом разбавления?

2. Какие методы используются для анализа микрофлоры воды и поч­вы?

3. Как произвести подсчет количества бактерий в 1л воздуха? На­сколько точным может быть такой подсчет?

4. Как получают чистые культуры микроорганизмов?

5. Как по чистой культуре можно установить, является ли микроорга­низм аэробным или анаэробным?

Тема 4. ПРЕВРАЩЕНИЯ БЕЗАЗОТИСТЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПОД ВЛИЯНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ

Занятие 6. Выращивание культур микроорганизмов,