Вектор - это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать размножение (клонирование) и работу (экспрессию) встроенного в неё искусственно какого-либо гена. Первым успешным вектором-повозкой в генной инженерии, стала кольцевая плазмида pSC101. Она несет один участок расщепления рестриктазой EcoR1 и превращается под действием этого фермента из кольцевой в линейную молекулу, концы которой могут «слипаться» между собой, она несет ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, а значит легко обнаруживается в бактериях. Все эти свойства pSC101 использованы для создания и клонирования первых гибридных ДНК. Плазмида pBR322, у нее больше участков, разрезаемых различными рестриктазами, с ней можно «сшивать» самые разные фрагменты ДНК, у нее два маркера для селекции на бактериальных средах: помимо тетрациклина эта плазмида кодирует еще устойчивость к ампициллину. Если один из этих генов (например, ген устойчивости к тетрациклину) разрезать определенной рестриктазой, то при встраивании в это место фрагмента чужеродной ДНК целостность гена нарушается и определяемый им признак исчезает. Это позволяет отбирать гибридные плазмиды. Трансформированные бактерии E. coli, т.е. содержащие гибридные плазмиды, растут на среде с ампицилином, но не растут на среде с двумя антибиотиками, потому что ген тетрациклиновой устойчивости в плазмиде повреждён вставкой. Селективный рост позволяет отбирать и выращивать только клетки, содержащие гибридные молекулы ДНК. Ген lacZ, в котором расположен полилинкер или участок содержащий 10 сайтов рестрикции. Колонии бактерий содержащие нормальный и повреждённый вставкой гены легко различаются если поместить клетки в чашки Петри на среду. Если образовались колонии, окрашенные в синий цвет, в этих бактериальных клетках плазмиды не содержат вставки чужеродной ДНК. Бактериальные клетки, которые содержат плазмиды со встроенной ДНК, образуют неокрашенные колонии. Гены подобные lacZ получили название репортерных.
Помимо плазмид в качестве векторов стали успешно использовать фаги и вирусы. Позже были созданы космиды – особый тип векторов, сочетающих свойства плазмиды и фага.
Способы получения необходимых генов в генной инженерии. Создание банков генов.
Введение чужеродных генов в клетки и контроль их экспрессии.
Плазмидные клетки вводятся вводятся в реципиентные клетки методом генетической трансформации (трансформация клеток кишечной палочки). В 1970г. Разработан метод введения ДНК в бактерии с использованием хлористого кальция для получения компетентных клеток. Метод электрофореза основан на принципе перемещения в электрическом поле веществ от одного полюса к другому со скоростью, зависящей от их размеров (позволяет следить за положением ДНК в геле). Отклонированную в векторах всю геномную ДНК или совокупность индивидуальных генов организма называют банком или библиотекой генов. Выделяют и очищают геномную ДНК из клеток организма, затем ее подвергают фрагментации с помощью рестриктаз, рекомбинантные молекулы затем клонируются. Банк может быть полным или частичным. Количество клонов зависит от размера генома и от величины фрагментов ДНК. Первый банк генов создан в 1976г. для кишечной палочки. Банки генов служат источником материала для изучения регуляции, структуры и функционирования генов и белков в организме. В 1969г. синтезирован ген алланиновой транспортной РНК дрожжей. В 1976г. синтезирован отрезок ДНК кишечной палочки, содержащий ген тирозиновой тРНК. Подходы к обнаружению и выделению генов: способ отбора на селективных средах, метод гибридизации с радиактивно меченным препаратом ДНК, для выделения генов также используются иммунологические методы, метод радиоиммунодитекции.
