Основные физические св-ва ДНК

В МБ выделяют разнообразные методы, кот. класс-т на 3 основные группы.

1. Физические. а) электронная микроскопия; б) рентгено-структурный анализ – определение пространственного расположения атомов в функциональных группах молекулы; в) седиментационный анализ – осаждение молекул при центрифугировании; – единица 1S (сверберг).

2. Химические. а) сиквинирование – определение последовательности расположения мономеров в гетерополимерах (ДНК и белки); б) авториография – включение в синтезированные молекулы молекул, меченых радиоактивных изотопов, и наблюдения за ними.

3. Биологические и биохимические. а) электрофорез – разделение макромолекул в их электрическом поле (проводится в преловидном геле). б) гибридизация – получение гибридных молекул разного происхождения. – а) в растворе; б) нитроцеллюлозном фильтре – блотинг (промокание). Здесь выделяют: саузер-блотинг (ДНК), ноузер-блотинг (ДНК- РНК), вестерн-блотинг (белок- белок). в) культура клеток – искусственные питательные среды в дабораторных условиях.

 

История изучения и доказательства генетической роли ДНК.

ДНК получена в 1868 г. Ф. Мишером из ядер погибших лейкоцитов.

1891 г. – Кессель показал, что ДНК состоит из остатков сахара (пептозы), фосфорной кислоты и четырех гетероциклических оснований (пурины и пиримидины).

1908 г. – Левин описал строение нуклеотида и показал, что он является мономером в структуре ДНК.

1944 г. – Эвери показал, что ДНК является носителем генетической информации.

1949-50 гг. – Чаргафф устанавливает количественное соотношение содержания нуклеотидов в ДНК.

1952 г. – Уилкинс получает первые рентгенограммы ДНК, из которых следует что она имеет двунитчатую структуру.

1953 г. – Уотсон и Крик разрабатывают модель строения ДНК.

Доказательства: 1. Опыты О. Эвери 1944 г. Суть опыта: смешивал два вида пневмококков, один из которых вызывал заболевание, а другой — нет. Предварительно болезнетворные клетки убивали и затем добавляли к ним пневмококки, которые не вызывали заболевания. Результаты опытов: некоторые из живых клеток после контакта с убитыми «научились» вызывать болезнь. О. Эвери выяснил: в процессе передачи информации от мертвых клеток к живым участвует ДНК.

2. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз в 1952 г. Суть опыта: фаги, у которых белковая оболочка была мечена радиоактивной серой (S35), а ДНК - радиоактивным фосфором (Р32), инкубировали с бактериями. Затем бактерии отмывали. В смывных водах не обнаруживали Р32, а в бактериях - S35 Следовательно, внутрь попала только ДНК. Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов, содержащих и белковую оболочку, и ДНК.

Отсюда следовал однозначный вывод о том, что именно ДНК выполняет генетическую функцию - несет информацию как о создании новых копий ДНК, так и о синтезе фаговых белков.

4. Строение ДНК. Модель Уотсона-Крика.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота, гетерополимер, мономером является нуклеотид. В состав ДНК входит 4 разновидности нуклеотидов А-аденин, Г-гуанин (пуриновые), Ц-цитозин, Т-тимин (пиримединовые). Модель Уотсона-Крика «двойная спираль»:1.Молекула ДНК представляет собой две взаимопереплитающиеся полинуклеотидные цепочки закрученные. 2.Нуклеотиды соединяются друг с другом при помощи фосфодиэфирных связей. 3.При образовании двойной спирали 2 полинуклеотидные цепочки соединяются дру с другом при помощи водородной связи, действует принцип комплементарности А компл Т 2 водородные связи, Г комп Ц 3 вод. связи. 4.Две полинуклеотидные цепочки полярны и антиполярны 5штрих_____3штрих 3штрих___5штрих.

Основные физические св-ва ДНК

1. Денатурация - происходит при действии химических факторов (мочевина, гуанидинхлорид, кислота, щелочь) и физических факторов (температура). Денатурация при действии температуры – плавление ДНК.

Гиперхромный эффект – увеличение оптической плотности ДНК при плавлении ДНК. Максимальное повышение оптической плотности раствора ДНК при длине волны 260 нм приблизительно равно 80 %, при полном распаде ее до мононуклеотидов.

2. Гибридизация - возможна гибридизация между различными молекулами ДНК и между ДНК и РНК.

 

Гибридизация позволяет выявить родство различных ДНК. Чем ближе родство, тем выше степень гибридизации.

Этапы гибридизации

-плавление ДНК

-перенос на нитроцеллюлозной фильтр

-фильтр помещают в раствор анализируемой ДНК

-отмывка не связавшейся ДНК

-анализ результатов гибридизации

 

 

6МБ. Репликация ДНК, её особ-ти у прокариот и эукариот. Репликация – процесс самовоспроизв-ия(самоудвоения) мол-л ДНК. В основе репликации лежит принцип комплементарности. В 1954г. Гюнтер Стенд предложил 3 возможные модели репликации: 1. Консервативная (вновь синтезированная (в.с-ая) молекула НК состоит только из дочерних полинуклеотидных последовательностей) 2.Полуконс-ая (в.с-ая молекула НК состоит из одной материнской и одной дочерней полинуклеотидных цепей НК) 3. Дисперсная (в.с-ая полинуклеотидная цепь НК состоит из фрагментов дочерних и материнских полинуклеотидных последов-тей). В 1957г. Мезенсон и Сталь в опытах по аналитич-му центрифугированию меченой радиоактивным изотопом ДНК показали, что репликация осущ-ся полуконсервативным способом (а у вирусов встречаются все три типа репликации). В живых системах из 1 материнской мол. ДНК получ. 2 дочерние, каждая из кот-х содержит 1 исходную и 1 вновь синтезируемую нить.

Особенности репликации у про- и эукариот. У прокариот: ДНК им. кольцевую форму и не связана с белками гистонами. 1). Высокая скорость репликации 1500 пар нуклеотидов в сек. 2). Им. 1 репликон.

Способы репликации кольцевой ДНК (типы): - тета-тип (ДНК бактерий) - D-тип (ДНК митохондрий).

У эукариот: Линейная форма ДНК и связана с белками гистонами (эти б-ки мешают репликации), образуя хроматин. 1). Низкая скорость репликации 10-100 п.н.в сек. 2). Множество репликонов (у дрозофилы 3500 репликонов).

Репликон – участок мол-ы ДНК в области которого происходит расплетение двойной спирали и осущ. процесс репликации.

7.Молекулярный мех.репл. Реплика́ция -процесс синтеза дочерней молекулы ДНК на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки.Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15—20 различных белков. Молекулярный механизм репликации. Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами. ДНК-полимераза I действует на запаздывающей цепи для удаления РНК-праймеров и дорепликации очищенных мест ДНК. ДНК полимераза III — основной фермент репликации ДНК, осуществляющий синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК.Синтез энергозатратный.Цепи молекулы ДНК расходятся, образуют репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

 

 

8. Репарация ДНК, ее молекулярные механизмы и значение. Репарация – процесс восстановления повреждений в структуре ДНК. Молекулы ДНК чувствительны к внешним воздействиям, в результате происходит изменение структуры ДНК (физ. Факторы, радиация, выс. температура). Механизмы репарации:1.фотореактивация. 2.экстазтонная. 3.пострепликационная. 4.сосрепарация. Образование димеров тимина при действии уф-излучения, димера тимина не подчиняются принципу комплементарности. 1.фотореакцивация – проиисходит на свету, фермент дезоксирибоперимединфотолаза. 2.экстационная р-я – режь и метай вырезают димеры тимина и застраивают брешь новыми нуклеотидами. Основные этапы: 1надрезание поврежденной нитиДНК. 2.врезание участка ДНК содержащего димер тимина фермент экзонуклеаза 3.застраивание бреши новыми нуклеотидами по принципу комплементарности.4.соединение сводных концов фермент лигаза. 3.Пострепликативный вкл. в себя процессы репликации и рекомбинации. 4.СОС репарация – вкл. при действии на клетку неблагоприятных факторов среды. Усраняет повреждения ДНК при помощи 1-3 механизмов.

 

9. Секвенирование ДНК. Методы Максама-Гилберта и Сенгера. Проект «Геном человека». Секвенирование – определение последовательности расположения нуклеотидов в ДНК. Выделяют два основных метода: 1) 1976г химический (метод Максама-Гилберта) – определ располож нуклеотидов в ДНК Один из наиболее распространенных методов секвенирования ДНК. Анализируемый фрагмент ДНК метится ³²Р с одного конца (3' или 5') и разделяется на четыре аликвоты, в каждой из которых с помощью специфического химического воздействия полинуклеотидная цепь расщепляется по определенным нуклеотидам (Ц; Ц+Т; Г; Г+А); затем образовавшиеся фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, что в конечном итоге по авторадиограмме позволяет расшифровывать нуклеотидную последовательность анализируемых фрагментов ДНК. (Нобелевская премия за 1980 г. совместно с Ф. Сенгером и П. Бергом). 2) 1975г – метод разработал Сенгер - ферментативный метод секренирования ДНК (искусственное прерывание репликации ДНК дидезоксинуклеотидами)

 

5 3

 

плавление

5 3

 

радиактивное мечение

5-конца (изотоп ³²Р)

 

³²Р АГЦАТГЦТАГЦА (13 нуклеотидов: 12+³²Р)

обработка спец. реактивом

разруш. 1 нуклеотид

А Т Г Ц

1,4,9,12 5,8 2,6,10 3,7,11

 

электрофорез по 4 дорожкам

-

А

Т

Г

Ц

12 ______

11 ______

10 ______

9 ______

8 ______

7 ______

6 ______

5 ______

4 ______

3 ______

2 ______

1 ______

+

2) 1975г – метод разработал Сенгер. Схема метода:

праймер

5 ТА 3

3 АТГУА 5

 

 

ddATP ddTTP ddGTP ddCTP

A T G C

__ __ __ __

осуществляется сверху

вниз со стороны 3-конца

 

 

Проект «Геном человека» стартовал в 1991г. Самый масштабный и дорогостоящий проект. Цель: полная расшифровка последовательности нуклеотидов ДНК человека (около 3,5 млрд нуклеотидов). Осуществляется усилием двух научных структур: 1. Международный консорциум ученых из разных стран (США, Германия, Япония, Англия, Франция и др.); 2. Частная компания Celera Genomics. Дата завершения проекта 2004 г. Однако, в 2001 г. Было объявлено о расшифровке нуклеотидной последовательности трех человеческих индивидуумов. В настоящее время идет изучение нуклеотидной последовательности с целью применения знаний в медицине и биотехнологии («геном прочитан, но не понят»). Число генов человека – около 30 тыс.

 

____

10. Структура, разновидности и функции РНК. Концепция «Мир РНК».

РНК явл. гетерополимером, мономером которого явл. нуклеотиды.

Длина молекулы РНК – от 70 до 10 тыс.нуклеотид.

Основные отличия от ДНК:

-одноцепочечная молекула

- в состав входит 3-углеродный сахар рибоза(ДНК- дезоксирибоза)

-нуклеотидный состав отлич. АГЦУ (уДНК – вместо урацила – тимин

Содержание Рнк в любой клетке превышает в 5-10 раз сод-ие ДНК.

Основные разновидности Рнк:

Присутствуют во всех типах клетки:

1. Информационная Рнк(иРНК) – несет информацию о первичной структуре белков

2. Р-РНК- образует рибосомы

3. Т-Рнк- доставляет аминокислоты к месту биосинтеза белков

4. Мц-РНК(малая цитоплазматическая) – участвует в РНК интерференции

Только в эукариотических клетках:

5. Гя РНК(гетероядерная) – смесь транскриптов ядерных генов

6. Мя(малая ядерная) – участвует в процессинге.

Лучше всего изучена структура т-РНК, т.к. её удалось получить в кристаллическом виде и определить особенности пространственного расположения методом рентгеноструктурного анализа.

Т-РНК состоит из:Стебель, петля.

Структура «листа клевера»:

· Акцепторный стебель

· Дегидриуридиновый стебель, дегидриуридиновая петля

· Антикодон, антикодоновый стебель, антикодоновая петля

· Добавочный стебель, вариальная петля

· Псевдоуридиновый стебель, псевдоуридиновая петля.