Раздел 7. Обмен нуклеотидов

РАБОТА 14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ФЕНАНТРОЛИНОВЫМ МЕТОДОМ

БЕЗ ДЕПРОТЕИНИЗАЦИИ

Цель работы: ознакомиться с унифицированным колориметрическим методом определения мочевой кислоты.

Задачи:

· определить содержание мочевой кислоты в крови (и моче);

· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.

Мочевая кислота является конечным продуктом метаболизма пуринов в организме человека, у других млекопитающих она под действием уриказы расщепляется до аллантоина.

Уровень концентрации мочевой кислоты в сыворотке и моче человека является важным показателем в диагностировании и контроле эффективности лечения таких заболеваний, как подагра, почечная недостаточность, лейкоз, врождённые дефекты ферментов распада пуриновых нуклеотидов.

Принцип метода. Метод основан на восстановлении фенантролинового комплекса мочевой кислотой.

Ход работы. В три пробирки вносят реагенты согласно таблице:

Реагенты	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Реагент № 1	1,8 мл	1,8 мл	1,8 мл
Реагент № 2	0,2 мл	0,2 мл	0,2 мл
Стандартный раствор мочевой кислоты	-	0,05 мл	-
Сыворотка крови (моча)	0,05 мл	-	-
Дистиллированная вода	-	-	0,05 мл

Примечание. Мочу перед проведением анализа развести в 10 раз физраствором.

Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают при комнатной температуре точно 5 минут. Пробы колориметрируют против контрольной пробы при длине волны 490 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 (5) мм.

Результаты.

Концентрацию мочевой кислоты в крови рассчитывают по формуле:

С = Е_оп / Е_ст × 595 (мкмоль/л) или С = Е_оп / Е_ст × 10 (мг%),

где Е_оп и Е_ст – экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной пробы;

595 или 10 – концентрация мочевой кислоты в стандартном растворе в мкмоль/л или мг% соответственно.

Концентрацию мочевой кислоты в моче рассчитывают по формуле:

С = Е_оп / Е_ст × 595 × 10× К (мкмоль/сут)

или С = Е_оп / Е_ст × 10× 10 × К (мг/сут),

где Е_оп и Е_ст – экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной пробы;

595 или 10 – концентрация мочевой кислоты в стандартном растворе в мкмоль/л или мг%, соответственно;

10 – разведение мочи перед анализом;

К – количество суточной мочи, л.

В сыворотке здорового человека концентрация мочевой кислоты, определённая данным методом, составляет 238-506 мкмоль/л (4,0-8,5 мг%) у мужчин и 167-446 мкмоль/л (2,8-7,5 мг%) у женщин. В моче концентрация мочевой кислоты составляет 1490-4460 мкмоль/сут (250-750 мг/сут).

Выводы:

 

РАЗДЕЛ 8. БИОХИМИЯ КРОВИ

РАБОТА 15. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ

В СЫВОРОТКЕ ИЛИ ПЛАЗМЕ КРОВИ УНИФИЦИРОВАННЫМ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Цель работы: ознакомиться с унифицированным методом определе-ния кальция в сыворотке крови.

Задачи:

· определить содержание кальция в сыворотке крови;

· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Кальций является жизненно важным элементом. Основное его количество в организме (до 99%) находится в скелете в виде нерастворимого комплекса фосфатных и карбонатных солей. Кальций участвует в процессах нейромышечной возбудимости, мышечного сокращения, влияет на проницаемость клеточных мембран, принимает участие в свёртывании крови и действии многих ферментов, повышает фагоцитарную активность лейкоцитов.

Изменение содержания кальция в сыворотке крови служит диагностическим тестом при эндокринных и неврологических заболеваниях и болезнях, вызванных недостатком некоторых витаминов (например, витамина D). В норме содержание кальция в сыворотке крови человека составляет 9-11 мг%.

Принцип метода. Кальций в щелочной среде образует окрашенный комплекс с о -крезолфталеин комплексоном. Интенсив-ность окраски пропорциональна концентрации кальция в пробе.

Ход работы. В три пробирки вносят реагенты, согласно таблице:

 

	Опытная проба, мл	Калибровочная проба, мл	Контрольная проба, мл
Сыворотка или плазма	0,05	-	-
Дистиллированная вода	-	-	0,05
Реагент № 1	1,0	1,0	1,0
Реагент № 2	1,0	1,0	1,0
Стандартный раствор Ca2+	-	0,05	-

 

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют 5 минут при температуре 20-25˚С. Измеряют оптическe. плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах на 5 мм (10 мм) при длине волны 570 нм (ФЭК 540-590 нм). Окраска растворов стабильна не менее часа. Если концентрация кальция превышает 3,75 ммоль/л (15 мг%), разведите образец в 2 раза дистиллированной водой, повторите анализ и умножьте результат на 2.

Результаты: концентрацию кальция рассчитывают по формуле:

С = Е_оп / Е_ст × 2,5 (ммоль/л), или

С = Е_оп / Е_ст × 10 (мг%),

где Е_оп и Е_ст – экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной пробы;

2,5 и 10 – концентрация кальция в стандартном растворе в ммоль/л и мг%, соответственно.

В сыворотке здорового человека содержание кальция, определён-ное данным методом составляет 2,02-2,6 ммоль/л (8,1-10,4 мг%).

Выводы:

 

РАБОТА 16. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МОЛИБДАТНЫМ UV-МЕТОДОМ

Цель работы: ознакомиться с унифицированным колориметричес-ким методом определения неорганического фосфора крови.

Задачи:

· определить содержание фосфора в крови;

· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.

Принцип метода: неорганический фосфор образует в растворе серной кислоты при взаимодействии с молибдатом аммония фосфомолибдатный комплекс. Окраска раствора пропорциональна концентрации фосфора в пробе.

Ход работы. В три пробирки вносят реагенты согласно таблице:

 

	Опытная проба, мл	Калибровочная проба, мл	Контрольная проба, мл
Сыворотка крови	0,02	-	-
Дистиллированная вода	-	-	0,02
Рабочий реагент	2,0	2,0	2,0
Стандартный раствор фосфора	-	0,02	-

 

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют 5 минут при температуре 20-25˚С. Измеряют оптическe. плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах на 5 мм (10 мм) при длине волны 340 нм. Окраска растворов стабильна в течение суток.

Результаты: концентрацию фосфора рассчитывают по формуле:

С = Е_оп / Е_ст × 1,615 (ммоль/л) или

С = Е_оп / Е_ст × 5 (мг%),

где Е_оп и Е_ст – экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной пробы;

1,615 или 5 – концентрация фосфора в стандартном растворе в ммоль/л или мг%, соответственно.

В сыворотке здорового человека содержание фосфора, определён-ное данным методом, составляет 0,87-1,45 ммоль/л (2,7-4,5 мг%).

Выводы:

 

РАЗДЕЛ 9. БИОХИМИЯ МОЧИ

 

Моча – секрет, вырабатываемый почками из плазмы крови. Важнейшей функцией почек является выделение из крови конечных продуктов обмена веществ и поддержание водно-солевого баланса в организме. За сутки через сосуды почек проходит более 1000 л крови и фильтруется 180 л первичной мочи. Около 1% профильтрованной почками жидкости превращается во вторичную мочу, а остальная часть первичной мочи (~99%) с растворёнными в ней веществами подвергается реабсорбции в проксимальных канальцах. С мочой выделяется до 150 различных веществ. В суточной моче содержится около 40 г органических соединений и до 20 г неорганических.

Исследование химического состава мочи имеет большое значение, так как изменение химических процессов в организме приводит к изменению качественного и количественного состава мочи, а также к появлению в ней необычных компонентов. Результаты исследования мочи используют при постановке диагноза многих заболеваний и для контроля эффективности методов лечения.

Моча выделяется из организма периодически, и отдельные её порции в течение суток могут отличаться по физико-химическим свойствам и химическому составу. Поэтому для клинического анализа обычно берут мочу натощак, после ночного сна. Более тщательный количественный анализ проводят в порции, собранной в течение суток. Для определения биологически активных и быстро разлагающихся компонентов мочу исследуют сразу же, после сбора. Анализ мочи включает: изучение физико-химических свойств (количество, цвет, запах, прозрачность, плотность, титрационную и истинную кислотность); качественного и количественного состава мочи и микроскопическое исследование осадка, в котором могут быть обнаружены различные соли, эпителиальные клетки, клетки крови и бактерии.

 

РАБОТА 17. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОЧИ

Цель работы: провести общий анализ мочи, включённый в перечень обязательных исследований независимо от предпола-гаемого диагноза.

Задачи:

· определить количество, цвет, прозрачность, запах, плот-ность мочи;

· изучить кислотно-основные свойства мочи;

· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.

1. Количество мочи

За сутки взрослый человек выделяет в среднем 1500 мл мочи. Суточное количество мочи может колебаться в широких пределах. Объём выделяемой мочи зависит от питьевого режима и количества воды, выводимой из организма через кожу, кишечник и лёгкие.

Определение суточного количества мочи (диуреза) позволяет судить о функции почек и сердечно-сосудистой системы. Патологическое уменьшение количества мочи (олигурия) наблюдается при остром нефрозе, пороках сердца. Увеличение диуреза (полиурия) бывает при сахарном диабете и гипофункции нейрогипофиза. Полное прекращение выделения мочи (анурия) обнаруживается при заболеваниях почек, непроходимости мочеточников, отравлениях ртутью, свинцом или мышьяком.

2. Цвет мочи

Цвет нормальной мочи обычно жёлтый с разными оттенками от бледно-жёлтого до оранжевого. Окраска мочи зависит от присутствия в ней пигментов. Урохром окрашивает мочу в тёмно-жёлтый цвет, уробилин – слабо-розовый, уроэритрин – красноватый. После употребления в пищу некоторых продуктов (например, свеклы) или приёма лекарственных препаратов (пирамидон, антипирин, нитроксолин) моча приобретает розово-красный цвет.

При различных заболеваниях окраска мочи может меняться. Так, при увеличении в моче количества уробилина (уробилинурия) моча имеет тёмно-красный или красно-бурый цвет, что указывает на серьёзные заболевания печени. Кровяные пигменты окрашивают мочу в розовый или коричневый цвет, а желчные пигменты – в зелёный или жёлто-коричневый. В случае присутствия гноя моча белёсая, опалесцирующая. Чёрная моча – признак алкаптонурии. При врождённой эритропоэтической порфирии моча красного цвета.

Цвет мочи обычно определяют терминами: соломенно-жёлтая, жёлтая, янтарно-жёлтая, шафранно-жёлтая, розово-жёлтая, оранжевая, красная, кроваво-красная, буро-красная, бурая, жёлто-коричневая и зеленовато-бурая.

3. Прозрачность мочи

Свежесобранная моча здорового человека прозрачна, но при стоянии в ней появляется небольшая муть, состоящая в основном из муцина и эпителиальных клеток. Осадок в такой моче незначителен и может быть аморфным (фосфаты, ураты) или кристаллическим (мочевая кислота, оксалаты, фосфаты). Пена мочи в норме – белая, быстро исчезающая.

Наличие сильной мути в свежей моче свидетельствует о патологическом изменении в организме. Щелочная моча бывает мутной вследствие выпадения в осадок фосфатов кальция, магния и аммония; при подкислении эта муть исчезает. Красноватый осадок в моче состоит из солей мочевой кислоты (уратов). При наличии белка в моче появляется устойчивая пена. Кровь, гной и белок обуславливают муть, появляющуюся при патологических процессах в почках и мочевыводящих путях.

Прозрачность мочи выражают определениями: прозрачная, слегка мутная, опалесцирующая, мутноватая, мутная, очень мутная, молочно-мутная.

4. Запах мочи

Запах свежей нормальной мочи слабо ароматический, несколько напоминающий запах мясного бульона или свежесваренных яиц. Долго стоявшая моча пахнет аммиаком. При употреблении в пищу чеснока или хрена моча приобретает неприятный запах. Процессы разложения сопровождаются выделением гнилостной, зловонной мочи. У больных сахарным диабетом отмечается плодовый (фруктовый) запах мочи.

 

5. Определение плотности мочи

В норме относительная плотность мочи колеблется в пределах 1,010-1,025 кг/л и обычно составляет 1,017-1,020 кг/л. Эти колебания зависят от количества введённой в организм жидкости и жидкости, выведённой из организма внепочечными путями. Обычно чем больше диурез, тем меньше плотность мочи. Резкое снижение плотности мочи происходит при несахарном мочеизнурении. Высокая плотность мочи наблюдается при сахарном диабете, лихорадочных состояниях, общем венозном застое.

Для определения плотности мочи используют специальные ареометры, которые называются урометрами. Урометры бывают двух типов: первый – для мочи с низкой и нормальной плотностью (с делениями от 1,000 до 1,030), второй – для мочи с высокой плотностью (с делениями от 1,030 до 1,060).

Ход работы. Для анализа берут цилиндр ёмкостью 100 мл, диаметр которого на 1-2 см больше диаметра широкой части урометра. Наклонив цилиндр, наливают в него медленно по стенке (во избежание образования пены) 60-75 мл исследуемой мочи. Если пена всё же образовалась, то её удаляют фильтровальной бумагой. Затем в цилиндр осторожно опускают сухой чистый урометр (он не должен касаться стенок и дна цилиндра). Лёгким толчком по верхушке урометра заставляют его совершить несколько небольших движений вверх и вниз и, когда он остановится, производят отсчёт плотности мочи по нижнему мениску. Если урометр всплывает наверх или, наоборот, тонет, то его заменяют другим – более тяжёлым или более лёгким.

Каждый урометр калиброван при определённой указанной на нём температуре (обычно 15˚С). Если определение плотности мочи происходит при других температурных условиях, то вносят поправку: на каждые 3˚С выше указанной температуры к показанию урометра прибавляют по 0,001, а на каждые 3˚С ниже – вычитают 0,001.

Если мочи мало, её разводят вдвое дистиллированной водой, перемешивают и определяют плотность разведённой мочи. При расчёте последние две цифры полученного результата умножают на разведение. Например, если плотность разбавленной мочи оказалась равной 1,021, то 21 × 2=42. Следовательно, плотность неразбавленной мочи – 1,042.

 

 

6. Исследование кислотно-основных свойств мочи

а) Определение реакции мочи

Моча может быть кислой, слабокислой, нейтральной, слабощелочной или щелочной. Активная реакция мочи (истинная кислотность, рН) зависит от соотношения в ней одно- и двухзамещённых фосфатов натрия и калия, при этом значение рН может колебаться в пределах 4,5-8,4. В нормальных условиях при смешанном питании у детей старшего возраста и взрослых людей моча слабокислая или нейтральная (рН 5-7). У новорожденных реакция мочи более кислая (рН 5,4-5,9), но уже на 2-4-й день после рождения рН быстро возрастает и при грудном вскармливании держится в пределах 6,9-7,8. В норме кислотность мочи зависит от характера пищи. Если в пище преобладают мясные продукты, моча становится более кислой. Растительная пища обуславливает щелочную реакцию мочи. Увеличение рН наблюдается также после приёма щелочных минеральных вод.

Реакция мочи может изменяться при заболеваниях. Патологические сдвиги рН в кислую сторону имеют место при сахарном диабете, подагре, голодании, почечной недостаточности и других болезнях. Моча становится щелочной после обильной рвоты, в период уменьшения сильных отёков, при инфекциях мочевого пузыря и мочевыводящих путей.

Ход работы:

· Определение реакции мочи на лакмус

На предметное стекло, лежащее на листе белой бумаги, кладут красную и синюю лакмусовую бумажку. Стеклянной палочкой наносят на них по капле мочи, наблюдают изменение окраски и делают выводы. При этом возможны следующие результаты:

- синяя лакмусовая бумажка краснеет, а красная не меняет своего цвета – реакция мочи кислая;

- красная лакмусовая бумажка синеет, окраска синей бумажки не меняется – реакция мочи щелочная;

- обе лакмусовые бумажки не изменяют своего цвета – нейтральная реакция мочи;

- обе лакмусовые бумажки меняют свой цвет (бывает очень редко) – наличие амфотерных компонентов в моче.

· Определение рН мочи по универсальной индикаторной бумажке.

На предметное стекло, положенное на лист белой бумаги, кладут полоску универсальной индикаторной бумажки, на которую наносят стеклянной палочкой каплю мочи. Окраску пятна сравнивают с контрольной полоской, прилагаемой к набору или расположенной на корпусе коробки.

б) Исследование титруемой кислотности и аммиака в моче

Под титруемой (титрационной) кислотностью мочи понимается общее количество кислореагирующих веществ, определяемое титрованием мочи щелочью в присутствии индикатора фенолрота. Кислотность мочи зависит, главным образом, от количества однозамещенных фосфатов (NaH₂PO₄, KH₂PO₄). Исследование титруемой кислотности мочи дает более точное представление о выделении почками катионов водорода, чем определение рН, и имеет большое значение для оценки кислотно-щелочного равновесия в организме. В норме титруемая кислотность свежей мочи равна 250-600 мл (40-75 ммоль) 0,1н раствора NaOH в пересчёте на суточное количество мочи. Выраженная в количестве соляной кислоты титруемая кислотность нормальной мочи колеблется в пределах 1-2,3 г HCl в сутки.

Показатели титруемой кислотности мочи понижаются при циститах, нефрозах, после сильной рвоты, после приёма щелочных минеральных вод и повышаются при метаболических и респираторных ацидозах.

Обычно титруемую кислотность мочи определяют наряду с количеством аммиака (катионов аммония), входящего в состав солей аммония. Количество аммиака в моче является важным показателем состояния равновесия кислот и оснований, а также скорости выведения из организма кислот, нейтрализованных аммиаком. На долю аммиака приходится 3-6% общего азота нормальной мочи.

Количество аммиака в норме у взрослых людей составляет 0,5-1,5 г/сутки (29,4-88,0 ммоль/сутки). Установлено постепенное увеличение выделения аммиака с мочой в постнатальный период. Если моча новорожденных почти не содержит аммиака, то к шестимесячному возрасту в суточной моче обнаруживается 70-140 мг аммиака, к концу первого года жизни – 100-190 мг, а в 14 лет – 600-1000 мг.

Количество аммиака в моче повышается при респираторных и метаболических ацидозах, первичном альдостеронизме, цистопиелитах. В тяжёлых случаях количество аммиака может достигать 5 г/сутки (~30% общего азота мочи).

Понижение выделения аммиака с мочой отмечается при гипофункции надпочечников, метаболическом и респираторном алкалозе, нарушении в почках процессов образования аммиака из глутамина (при участии глутаминазы).

· Определение титруемой кислотности мочи по методу Фолина

Принцип метода. После осаждения кальция щавелевокислым калием мочу титруют 0,1н раствором гидроксида натрия в присутствии фенолфталеина. Оксалат калия препятствует разложению солей аммония и образованию фосфорнокислого кальция Са₃(РО₄)₂, изменяющего результат титрования.

Ход работы. В плоскодонную колбочку на 50 мл вносят 5 мл мочи, 1 г щавелевокислого калия и 1-2 капли 0,5%-го спиртового раствора фенолфталеина. Смесь тщательно перемешивают в течение 2 минут, после чего титруют 0,1н раствором гидроксида натрия до появления устойчивого розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты.

Результаты: титруемую кислотность мочи выражают в количестве миллилитров 0,1н раствора NaOH, необходимом для нейтрализации кисло реагирующих веществ, содержащихся в суточной моче. Расчёт производят по формуле:

C = (a × d) / b,

где С – титруемая кислотность суточной мочи в мл 0,1н раствора NaOH;

а – количество 0,1н NaOH (в мл), пошедшее на титрование пробы;

b – количество мочи (в мл), взятое для титрования;

d – суточный объём мочи;

Для пересчёта в единицы системы СИ (ммоль/сутки) полученный результат (С) умножают на коэффициент 0,1.

Полученный результат (С) можно пересчитать на соляную кисло-ту, зная, что 1 мл 0,1н раствора NaOH эквивалентен 0,00365 г HCl.

Выводы:

РАБОТА 18. КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ НОРМАЛЬНОЙ МОЧИ

Цель работы: провести качественный анализ мочи, включённый в перечень обязательных исследований независимо от предполагаемого диагноза.

Задачи:

· определить неорганические компоненты мочи;

· определить органические компоненты мочи;

· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.

 

I. Неорганические составные части мочи

В суточной моче 12-25 г минеральных веществ. Эти вещества находятся в моче в форме катионов (К⁺, Na⁺, Са²⁺, Mg²⁺, NH₄⁺) и анионов (Cl^-, SO₄^2-, H₂PO₄^-, HPO₄^2-) Неорганические компоненты мочи являются продуктами обмена веществ в тканях или поступают из кишечника.

 

1. Реакция на хлориды

Катионы натрия, калия, аммония, кальция и магния выделяются с мочой преимущественно в виде хлористых солей. Количество хлоридов в суточной моче здорового человека приблизительно соответствует содержанию поваренной соли в пище и равно 10-15 г. Задержка хлоридов в организме свидетельствует о нарушении водно-солевого обмена и наблюдается при поражениях печени и почек, онкологических заболеваниях, крупозной пневмонии и других болезнях.

Принцип метода. При добавлении к моче, подкисленной азотной кислотой, нитрата серебра выпадает белый осадок хлористого серебра, нерастворимый в азотной кислоте, но растворимый в гидроксиде аммония:

HNO₃

NaCl + AgNO₃ → AgCl↓ + NaNO₃

 

AgCl + 2NH₄OH → [Ag(NO₃)₂]Cl + 2H₂O

комплексное

соединение

Ход работы. В пробирку вносят 2 мл мочи, 2 капли 1%-го раствора азотнокислого серебра и 2 капли 10%-го раствора азотной кислоты, перемешивают и наблюдают появление белого творожистого осадка хлорида серебра, постепенно темнеющего на свету. Примерно половину содержимого отливают в другую пробирку. В первую пробирку добавляют 2-3 капли 10%-го раствора азотной кислоты (осадок не растворяется), а во вторую – 2-3 капли 10%-го раствора гидроксида аммония. Осадок во второй пробирке растворяется.

 

2. Реакции на фосфаты

Фосфор выделяется с мочой в виде фосфатов калия, натрия, аммония, кальция и магния. Количество фосфора, выделяемого с мочой, отражает интенсивность обмена в организме органических и неорганических фосфатов и в норме у взрослого человека равно 0,5-2 г в сутки. Уровень фосфатов в моче повышается при гиперпаратиреозе, лейкемии, диабете и снижается при рахите, гипопаратиреозе, остеопорозе.

Реакция с гидроксидом аммония

Принцип метода. Двузамещённые фосфаты кальция и магния взаимодействуют с гидроксидом аммония с образованием нерастворимых солей:

3CaHPO₄ + 3NH₄OH → Ca₃(PO₄)₂↓ + (NH₄)₃PO₄ + 3H₂O,

MgHPO₄ + NH₄OH → Mg(NH₄)PO₄↓ + H₂O.

Ход работы. К 2-3 мл мочи добавляют 1 мл 2%-го раствора гидроксида аммония, перемешивают и наблюдают появление осадка нерастворимых фосфатов кальция и магния. Смесь фильтруют через бумажный фильтр и к фильтрату прибавляют несколько капель магнезиальной смеси (раствор хлоридов аммония и магния в концентрированном растворе гидроксида аммония), которая осаждает другие фосфаты.

 

3. Реакции на сульфаты и эфиросерные кислоты

Серусодержащие соединения мочи образуются в основном в результате метаболизма аминокислот. Сера выделяется в виде неорганических сульфатов и солей эфиросерных кислот. Небольшая часть серы мочи представлена цистеином, метионином, роданидами, сульфидами и другими веществами. Суточная моча здорового человека содержит в среднем 1,8 г сульфатов (в пересчёте на серу). Количество выделяемых сульфатов зависит от содержания белка в пище. Количество солей эфиросерных кислот в моче в норме невелико (до 0,04 г/сутки), но оно увеличивается при усилении гнилостных процессов в кишечнике, сопровождающихся образованием фенола, крезола, индола и скатола.

Принцип метода. Сульфаты мочи реагируют с хлоридом бария с образованием белого осадка сернокислого бария, нерастворимого в кислотах и щелочах:

Na₂SO₄ + BaCl → BaSO₄↓ + 2NaCl.

После удаления осадка фильтрованием и гидролиза солей эфиросерных кислот образовавшаяся серная кислота реагирует с хлористым барием с выпадением в осадок сульфата бария:

H₂SO₄ + BaCl₂ → BaSO₄↓ + 2HCl

Ход работы. В пробирку вносят 1 мл мочи и 5 капель 10%-го раствора соляной кислоты. Затем добавляют по каплям 5%-й раствор хлористого бария до полного осаждения сульфата бария (до тех пор, пока новая капля хлористого бария не приведёт к усилению помутнения). Смесь фильтруют через бумажный фильтр в другую пробирку. Фильтрат, содержащий растворимые соли эфиросерных кислот, помещают в кипящую водяную баню на 10 минут. Жидкость в пробирке мутнеет в результате освобождения серной кислоты и появления новой порции сульфата бария. Образующийся фенол окрашивает реакционную смесь в розоватый цвет.

4. Реакции на кальций и магний

Кальций и магний выводятся через почки в виде солей в небольшом количестве. Установлено, что с мочой выделяется примерно 30% выводимого из организма кальция и магния. Основная часть этих щелочно-земельных металлов является составной частью кала. В течение суток с мочой здорового человека выводится 0,1-0,25 г (2,5-6,2 ммоль) кальция и 0,1-0,2 г (4,2-8,4 ммоль) магния.

При взаимодействии солей кальция со щавелевокислым аммонием образуется белый кристаллический осадок щавелевокислого кальция, нерастворимый в уксусной кислоте, но растворяющийся в минеральных кислотах:

После отделения оксалата кальция фильтрованием соли магния, находящиеся в фильтрате, реагирует с гидроксидом аммония с образованием небольшого осадка двойной аммоний-магниевой соли фосфорной кислоты (фосфорнокислой аммоний-магнезии):

MgНРО₄ + NH₄OH → Mg(NH₄)PO₄ + H₂O.

Ход работы. К 2 мл мочи прибавляют 4 капли 10%-го раствора уксусной кислоты и 5 капель 5%-го раствора щавелевокислого аммония. Выпадает белый кристаллический осадок оксалата кальция, хорошо заметный при взбалтывании. Жидкость фильтруют и к фильтрату добавляют 7-10 капель 10%-го раствора гидроксида аммония (до щелочной реакции на лакмус). Через 2-3 минуты наблюдается лёгкое помутнение раствора из-за выпадения в осадок фосфорнокислой аммоний-магнезии. Осадок этой соли небольшой, кристаллический, лучше видимый при взбалтывании и рассматривании жидкости в проходящем свете. Кристаллизацию можно ускорить потиранием стеклянной палочкой о внутреннюю стенку пробирки в растворе.

5. Реакция на аммонийные соли

На долю аммонийных солей приходится 4-5% общего количества азота мочи, что соответствует 0,5-1,0 г (36-71 ммоль) аммиака в сутки.

Принцип метода. Аммонийные соли реагируют с гидроксидом кальция с образованием гидроксида аммония, разлагающегося при нагревании с выделением аммиака:

2NH₄Cl + Ca(OH)₂ → 2NH₄OH + CaCl₂,

_t°С

NH₄OH → NH₃↑ + H₂O.

Ход работы. В пробирку через воронку наливают 1,5-2 мл мочи и 1 мл насыщенного раствора гидроксида кальция (известкового молока). Осторожно вынимают воронку, стараясь не коснуться сливным концом внутренних стенок пробирки. Содержимое пробирки нагревают до кипения и сразу же подносят к отверстию красную лакмусовую бумажку, предварительно смоченную дистиллированной водой. Бумажка синеет вследствие выделения аммиака.

II. Органические составные части мочи

С мочой взрослого человека в течение суток выделяется около 40 г органических веществ. В моче здорового человека содержатся мочевина, креатинин, мочевая кислота, аминокислоты, гиппуровая кислота, безазотистые компоненты (в основном органические кислоты: щавелевая, молочная, лимонная, янтарная, масляная, валериановая) и другие соединения.

1. Реакции на мочевину

Мочевина – главный конечный продукт азотистого обмена. Количество мочевины, выделяемой с мочой, в норме составляет 20-35 г/сутки (333-583 ммоль/сутки).

Реакция с бромноватистокислым натрием

Принцип метода. Мочевина разлагается бромноватистой щелочью натрия (щелочным раствором бромноватистокислого натрия) с выделением свободного азота:

Образовавшаяся угольная кислота связывается щелочью натрия:

Н₂СО₃ + 2NaOH → Na₂CO₃ + 2H₂O.

Ход работы. К 2-3 мл мочи приливают 0,5 мл щелочного раствора бромноватистокислого натрия и наблюдают выделение пузырьков азота.

2. Реакции на мочевую кислоту

Мочевая кислота – конечный продукт обмена пуриновых азотистых оснований. В норме с мочой выделяется в течение суток 0,2-1,2 г (1,2-7,1 ммоль) мочевой кислоты.

Реакция с азотистокислым серебром

Принцип метода. При взаимодействии мочевой кислоты с азотистокислым серебром в присутствии гидроксида аммония образуется осадок мочекислого серебра бурого цвета:

Ход работы. К 1 мл мочи добавляют 1 каплю 15%-го раствора гидроксида аммония, 5 капель 1%-го раствора нитрата серебра и перемешивают. При стоянии через 3-5 минут выпадает незначитель-ный рыхлый осадок мочекислого серебра, окрашенный в бурый цвет.

3. Реакции на креатинин

Креатинин является одним из конечных продуктов азотистого обмена. Азот креатинина составляет 2,5-7,0% всего азота мочи. За сутки с мочой выделяется 1,0-2,0 г (8,8-17,7 ммоль) креатинина у мужчин и 0,8-1,8 г (7,1-15,9 ммоль) – у женщин. Гиперкреатинурией сопровождаются лихорадочные состояния, острые инфекции, сахарный диабет, мышечные атрофия и дистрофия, миастения. Гипокреатинурия наблюдается при болезнях почек, алиментарной дистрофии, в старческом возрасте.

Реакция Яффе с пикриновой кислотой

Креатинин реагирует с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием таутомера пикрата креатинина, имеющего оранжево-красный цвет:

Ход работы. К 1 мл мочи прибавляют 5-6 капель 10%-го раствора гидроксида натрия, 4-5 капель насыщенного раствора пикриновой кислоты и перемешивают. Появляется оранжево-красная окраска, усиливающаяся при стоянии.

 

Результаты оформите в виде таблицы.

Название реакции	Исследуемый компонент	Используемые реактивы	Наблюдаемый результат	Чем обусловлена реакция
Неорганические компоненты
Органические компоненты

Выводы:

 

 

РАБОТА 19. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА КОМПОНЕНТЫ ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ МОЧИ

Цель работы: ознакомиться с методами определения возможных компонентов патологической мочи.

Задачи:

· определить содержание белка, глюкозы, кетоновых тел, крови в представленных образцах патологической мочи;

· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

 

1. Качественные реакции на белок в моче

В нормальной моче содержатся лишь следовые количества белка, которые не обнаруживаются обычными качественными реакциями. При патологических состояниях белок в моче выявляется качественным и количественным анализом. Белок в моче появляется при нефритах, нефрозах, сердечной декомпенсации, острых инфекционных и других заболеваниях.

Принцип метода. Для качественного обнаружения белка в моче используют реакции, основанные на его денатурации. Перед анализом мочу фильтруют.

а) Реакция с сульфосалициловой кислотой

Ход работы. В 2 пробирки (опыт и контроль) наливают по 1-2 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку добавляют 2-3 капли 20%-го раствора сульфосалициловой кислоты, а в контрольную – 2-3 капли дистиллированной воды. Содержимое каждой пробирки перемешивают и сравнивают опыт и контроль в проходящем свете на чёрном фоне. Если моча содержит белок, то в опытной пробирке раствор мутнеет или выпадает белый осадок. Реакция с сульфосалициловой кислотой является самой чувствительной качественной пробой на белок и позволяет выявить 0,015 г/л белка.

б) Проба Геллера

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл 50% азотной кислоты. Затем пробирку наклоняют под углом 45° и осторожно по стенке приливают из пипетки 1 мл профильтрованной мочи. Моча, имеющая меньшую плотность, наслаивается на кислоту. Пробирку переводят в прежнее вертикальное положение и рассматривают границу жидкостей в проходящем свете на чёрном фоне. При наличии белка в моче на границе двух жидкостей (кислота / моча) образуется белый аморфный осадок или муть в виде кольца.

При отсутствии белка иногда на границе жидкостей появляется красное прозрачное кольцо, обусловленное изменением пигментов мочи под действием азотной кислоты. Беловатое кольцо выше границы жидкостей может состоять из уратов, которые растворяются при нагревании.

в) Проба Ларионовой

Ход работы. Проба Ларионовой является модификацией пробы Геллера. В пробирку наливают 1-2 мл реактива Ларионовой (1%-й раствор азотной кислоты, приготовленный на насыщенном растворе хлорида натрия) и на него наслаивают профильтрованную мочу. Присутствие белка в моче обнаруживают по появлению кольца на границе жидкостей.

 

2. Качественные реакции на сахара в моче (глюкозу)

Углеводы (в основном моносахариды) появляются в моче при различных патологических состояниях. Так, фруктоземия и фруктозурия сопровождаются выделением фруктозы. При мальтазном и лактазном дефицитах в моче можно обнаружить лактозу или мальтозу. Пентозы появляются в моче при пентозурии и прогрессирующей мышечной дистрофии. Выделение с мочой гликозаминогликанов свидетельствует о мукополисахаридозе. Наибольшее клиническое значение имеет выявление глюкозы в моче. Глюкозурия чаще всего обусловлена повышением сахара в крови при диабете или нарушением функции почек.

Принцип метода. Большинство качественных реакций на сахара основаны на их редуцирующих свойствах.

а) Проба Троммера

Ход работы. К 1 мл мочи приливают равный объём (1 мл) 2н раствора гидроксида натрия. Затем добавляют по каплям при постоянном перемешивании 0,25М раствор сульфата меди до появления голубого осадка, не исчезающего после встряхивания. Смесь нагревают до кипения. При наличии глюкозы голубая окраска переходит в жёлто-красную.

Если сульфат меди был добавлен в избытке, то при нагревании образуется чёрный осадок оксида меди (II), мешающий открытию глюкозы.

б) Проба Фелинга

В состав реактива Фелинга входят щелочь натрия, сульфат меди и сегнетовая соль, которая связывает избыток ионов меди, препятствуя выпадению чёрного осадка оксида меди (II).

Ход работы. В пробирку наливают по 0,5 мл растворов Фелинга I и Фелинга II и 1 мл исследуемой мочи. Содержимое перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 2-3 минут. Появление жёлтого или красноватого осадка свидетельствует о наличии глюкозы в моче.

в) Проба Бенедикта

Проба Бенедикта является самой чувствительной из всех качественных реакций на сахар в моче. Преимуществом этой пробы является также то, что реактив Бенедикта (смесь цитрата натрия, карбоната натрия и сульфата меди) практически не взаимодействует с другими редуцирующими органическими соединениями мочи. Проба Бенедикта может служить ориентировочным полуколичественным методом определения сахара в моче.

Ход работы. В пробирку наливают 1,5 мл реактива Бенедикта, добавляют 3-4 капли мочи и перемешивают. Смесь нагревают на кипящей водяной бане 2-3 минуты и охлаждают. При наличии сахара через 5-7 минут на дне пробирки появляется осадок, окраска которого зависит от концентрации глюкозы в моче:

 

№п/п	Цвет	Количество глюкозы, %
	зеленоватый (без осадка)	≤0,05
	горохово-зелёный	0,1- 0,3
	зелёный	0,5- 0,6
	жёлтый	1,0
	оранжевый	1,5
	красный	≥2

3. Качественные реакции на кетоновые тела в моче

Кетоновые (ацетоновые) тела состоят из ацетоацетата (ацетоуксусная кислота), β-гидроксибутирата (β-оксимасляная кислота) и ацетона.

Кетоновые тела образуются при распаде жирных кислот и кетогенных аминокислот (лейцина, изолейцина, фенилаланина и тирозина). В моче здорового человека кетоновые тела содержатся в минимальных количествах, которые не выявляются обычными качественными реакциями.

Кетонурия бывает алиментарной и патологической. Алиментарная кетонурия возникает вследствие дефектов диеты и наблюдается после длительного приёма жирной пищи или пищи, лишённой углеводов.

Кетонурия при патологических состояниях связана с нарушениями углеводного и липидного обмена, а также функции ЦНС. Чаще всего кетоновые тела появляются в моче при сахарном диабете, при этом кетонурия сочетается с глюкозурией. Кетоновые тела выделяются с мочой при голодании, истощении, лихорадочных состояниях, травмах черепа, резком эмоциональном возбуждении, тиреотоксикозе, синдроме Иценко – Кушинга. Кетонурия нередко наблюдается при инфекционных заболеваниях (скарлатине, гриппе, туберкулёзе, дизентерии, менингите и др.).

Кетонурия у детей встречается чаще, чем у взрослых. Это объясняется лабильностью обмена углеводов и склонностью к кетозу детей, особенно раннего возраста. Кетонурия является специфическим диагностическим признаком при ацетонемической рвоте, которая нередко бывает у истощённых детей, при токсической диспепсии.

а) Проба Ланге

Ход работы. В пробирку наливают 4-6 мл мочи и осторожно под тягой добавляют мерной пробиркой 1 мл концентрированной уксусной кислоты и 0,5 мл свежеприготовленного 10%-го раствора нитропруссида натрия. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой. Во вторую пробирку наливают под тягой 1,5-2 мл концентрированного раствора аммиака. Обе пробирки наклоняют под углом 45° и раствор аммиака медленно по стенке выливают (наслаивают) в первую пробирку.

Проба считается положительной, если в течение 3 минут на границе 2 жидкостей появляется розово-фиолетовое кольцо. Окраска кольца в присутствии ацетона слабая, а ацетоацетата – более интенсивная.

б) Проба Либена

Ход работы. К 2 мл мочи добавляют 10 капель 10%-го раствора гидроксида натрия и затем по каплям раствор Люголя (раствор йода в йодистом калии) до появления бледно-жёлтой окраски.

При наличии в моче кетоновых тел раствор мутнеет вследствие выпадения в осадок йодоформа (CHI₃), имеющего характерный запах, усиливающийся при нагревании.

 

 

4. Качественные реакции на кровь и кровяные пигменты в моче

Форменные элементы крови и кровяные пигменты (гемоглобин и его производные) – патологические составные части мочи. Появление в моче эритроцитов называется гематурией, а кровяных пигментов – гемоглобинурией. При гематурии моча непрозрачная, имеет красноватый оттенок; при микроскопическом исследовании осадка такой мочи обнаруживаются эритроциты и лейкоциты. Кровяные пигменты окрашивают мочу в красный или бурый цвет.

Гематурии бывают истинными и ложными (не связанными с патологиями почек и мочевыводящих путей). Истинные гематурии делятся на ренальные (почечные), постренальные (внепочечные) и смешанные.

Почечные истинные гематурии могут быть органического и функционального происхождения. Органические гематурии являются следствием поражения паренхимы почек (нефриты, нефрозы, инфаркт почек, тромбоз почечных вен). Функциональные почечные гематурии возникают из-за повышения почечного фильтра и чаще наблюдаются у детей грудного и раннего возраста при перегревании, инфекциях, рахите, бронхопневмонии, сепсисе.

Постренальные (внепочечные) гематурии бывают при воспалительных процессах, травмах мочевыводящих путей (пиелиты, пиелоциститы, мочевые камни, опухоли).

Гематурии смешанного типа встречаются при геморрагических диатезах, гипо- и авитаминозе С, анемиях, врождённых анатомических дефектах почек.

Гемоглобинурии делятся на две группы: первичные (идиопатические) и вторичные (симптоматические). Идиопатические гемоглобинурии выявляются после сильного охлаждения тела (холодовая гемоглобинурия), усиленной физической нагрузки (спортивная гемоглобинурия), эпилептического припадка. Симптоматические гемоглобинурии наблюдаются при переливании несовместимой по резус-фактору крови, при инфекционных болезнях (скарлатина, тиф, ангина, малярия), в результате отравления гемолитическими ядами (сероводородом, анилиновыми красителями, парами соляной и уксусной кислот и др.), после тяжёлой травмы, при гемолитических анемиях.

Принцип метода. Все качественные реакции на обнаружение крови в моче основаны на окислении некоторых органических соединений (гваяковой смолы, пирамидина, бензидина и др.) атомарным кислородом, который образуется при разложении пероксида водорода в присутствии гемоглобина, обладающего пероксидазным действием.

а) Бензидиновая проба

Ход работы. К 1 мл свежей мочи осторожно под тягой добавляют 1 мл бензидинового реактива и 8-10 капель 3%-го раствора перекиси водорода. Если в крови присутствует гемоглобин, то смесь окрашивается в синий или зелёный цвет.

При длительном стоянии мочи гемоглобин превращается в метгемоглобин, и тогда обнаружить кровь бензидиновой реакцией не удаётся. С такой мочой лучше сделать пробу Геллера.

б) Проба Геллера

Ход работы. К 2 мл мочи добавляют 5-6 капель 10-%-го раствора гидроксида натрия до сильно щелочной реакции по универсальной индикаторной бумажке. Затем смесь нагревают до кипения. Образуется хлопьевидный осадок фосфатов. В присутствии кровяных пигментов осадок фосфатов приобретает оранжево-коричневую окраску, при этом цвет осадка темнее цвета мочи. В нормальной моче осадок белый, его цвет светлее цвета мочи.

Результаты оформите в виде таблицы:

 

№п/п	Название реакции	Исследуемый компонент	Используемые реактивы	Наблюдаемый результат

Выводы: