РАБОТА 11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРОЛА В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Цель работы: ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерола.
Задачи:
· определить содержание общего (свободного и этерифи-цированного) холестерола в предложенной сыворотке крови;
· проанализировать полученные результаты и сделать вывод.
Принцип метода. При гидролизе эфиров холестеридов холестеролэстеразой образуется холестерол. Общий холестерол (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:
В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерола.
Ход работы. В две обычные химические пробирки наливают:
1) в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови,
2) в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерола.
Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля (кювета с рабочим реагентом) в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм.
Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.
Результаты: расчёт количества общего холестерола проводят по формуле:
С = Ео/Ест × 5,17 (ммоль/л) или С = Ео/Ест × 200 (мг/100мл),
где Ео – экстинкция опытной пробы,
Ест – экстинкция стандарта.
Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах:
20-29 лет – 3,72-7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл),
30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл),
40-49 лет – 4,40-8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл),
старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл).
Выводы:
РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Цель работы: ознакомиться с современным и самым распростра-нённым в клинической биохимии методом определе-ния α-холестерола в сыворотке крови.
Задачи:
· определить содержание холестерола липопротеинов высокой плотности (α-холестерола) в сыворотке крови;
· рассчитать холестериновый индекс атерогенности (ХИА);
· проанализировать полученные результаты и сделать выводы.
Принцип метода. Хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются фосфорновольфрамовой кислотой и Mg2+ и отделяются центрифугированием. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) остаются в надосадочной жидкости (супернатанте) и количество холестерола в них определяется так же, как концентрация общего холестерола, энзиматическим методом.
Ход работы
а) Осаждение ЛПОНП и ЛПНП
В три центрифужные пробирки наливают:
1) в опытную – 0,15 мл исследуемой сыворотки крови,
2) в стандартную – 0,15 мл стандартного раствора холестерола,
3) в контрольную – 0,15 мл дистиллированной воды.
Во все пробирки добавляют по 0,3 мл осаждающего реагента. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем опытную пробу центрифугируют в течение 15 минут при 3000 оборотах в минуту и прозрачный центрифугат используют для определения холестерола ЛПВП (α-холестерола). Стандартную и контрольную пробы можно не центрифугировать.
б) Определение концентрации α-холестерола
В три обычные химические пробирки (опытную, стандартную и контрольную) аккуратно автоматической пипеткой переносят по 0,2 мл жидкости из соответствующих центрифужных пробирок и добавляют по 2,0 мл рабочего реагента. Реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм при длине волны 490-500 нм.
Результаты:
1. Концентрацию холестерола ЛПВП (α-холестерола) рассчитывают по формуле:
С = Ео/Ест × 1,29 (ммоль/л) или С = Ео/Ест × 50 (мг/дл),
где Ео и Ест – экстинкции опытной и стандартной проб.
2. Холестериновый индекс атерогенности (ХИА) расчитывают по формуле:
ХИА = (общий холестерол – α-холестерол) / α-холестерол
В норме величина холестеринового индекса атерогенности ≤3,0.
Выводы:
