Биотехнологические методы получения ЛС на основе культур клеток растений имеют широкое распространение, поскольку по 4 страница

• отщепление бензильного радикала (остается 6-АПК);

• введение химическим путем других радикалов. Аналогичная работа возможна с цефалоспоринами при присоеди­нении различных радикалов к 7-аминоцефалоспорановой кислоте.

Другим направлением является использование комбинирован­ных препаратов, содержащих антибиотик вместе с ингибитором β-лактамаз. Примеры: уназин (ампициллин + сульбактам); амоксиклав (амоксициллин + клавулановая кислота); аугментин (амоксициллин + клавулановая кислота, но в другом соотношении).

Если резистентность обусловлена наличием генов клетки, кото­рые делают мембраны непроницаемыми для антибиотика (сужа­ются поры или снижается их количество), то в этом случае можно использовать β-лактамные антибиотики имипинем, карбопинем, веропинем, образующие, по сравнению с пенициллином, меньшие по размерам цвиттер-ионы, легко проникающие через пориновые каналы.

Можно также использовать и имитационные структуры пере­носчика, жизненно необходимого для клетки, проходящего через пориновые каналы. Так, например, был создан цефалоспорин, ими­тирующий переносчик железа, который, попадая в клетку, угнетал синтез пептидогликана, ингибируя транспептидазу.

Цефалоспорины III поколения (в частности, цефтазидим), хотя и не расщепляются β-лактамазами, но являются индукторами выра­ботки этих β-лактамаз. Цефалоспорины IV поколения (цефипим, цефпиром) уже не являются индукторами β-лактамаз.

Структурная формула амикацина включает фрагмент γ-оксимасляной кислоты, который защищает этот высокоактивный анти­биотик от инактивации со стороны изоферментов.

Система активного выброса антибиотиков обнаруживает в цитоплазматической мембране новые белки, проникающие в клетку. Эта система белков включает в себя «белок-ловушку, «линкерный белок» и «белок-помпу».

Аналогичная ситуация наблюдается и в отношении противоопу­холевых антибиотиков, что предопределяет их низкую терапевтиче­скую эффективность.

Пути повышения эффективности: создание липосомальных лекар­ственных форм антибиотиков, применение конъюгатов цефалоспо-ринов с фторхинолонами. Последние рассматривают как «prodrugs» (предлекарства), механизм их действия связан с подавлением актив­ности транспептидаз пептидогликана и ДНК-гиразы. Так, оливомицин, рубомицин, доксорубицин, блеомицин подавляют синтез и ДНК, и РНК одновременно, поэтому очень токсичны.

 

ЗАДАЧА 33

У патогенных микроорганизмов открыты гены, существенные для инфекционного процесса, но не существенные при росте в искус-

Вариант ответа

Большинство генов, продукты которых необходимы клетке всег­да, получили название «house keeping gens», что можно перевести, как «гены, на которых держится дом». Они экспрессируются в любых усло­виях, так как клетка без них не может существовать. Продукты экпрессии именно этих генов обнаруживают на питательных средах in vitro, поэтому практически все антибиотики, применяемые в клинической практике, являются ингибиторами функций именно этих генов.

Продукты некоторых генов не идентифицируют на питательных средах, и поэтому их дальнейшее использование в качестве таргетов при поиске новых ЛС невозможно. Эти так называемые молча­щие in vitro гены патогенных микроорганизмов получили название /w'-генов или генов вирулентности. Соотношение между house keeping и /v/'-генами в геноме у разных патогенных бактерий варьирует, но в среднем более 90% генов относится к 1-й группе (house keeping).

ivi-Гены, как правило, играют определяющую роль в развитии инфекционного процесса. Именно поэтому значительный интерес представляют пути выявления и выделения этих генов. Примером такой работы служит предложенный американскими генетиками метод «IVET» (In Vivo Expression Technology). Краткая суть метода описана ниже.

• Геном патогенной бактерии (например, Salmonella typhimurium) с помощью рестриктаз делят на сотни фрагментов (х₁, х₂, х₃, … x_n).

• Каждый отдельный фрагмент генно-инженерными метода­ми соединяют с лишенным промотора геном хлорамфениколацетилтрансферазы (cat). Такой ген (без промотора) не может реплицироваться при его введении в клетку. Однако этот ген сможет реплицироваться, если соединенный с ним ген (фрагмент ДНК сальмонеллы — х,, х₂, х₃ ... х_п) будет иметь промотор для своей репликации. Тогда этот промотор будет вызывать репли­кацию не только своего гена, но и следующего за ним гена (без промотора). Таким образом, репликация гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы может происходить за счет использования или «захвата» чужого промотора.

• К этому сдвоенному фрагменту (x-cat, где х — фрагмент генома сальмонеллы, a cat — ген хлорамфеникол-ацетилтрансферазы) присоединяется лактозный оперон (lac Z) также без промотора. Этот оперон нужен системе для окисления лактозы.

• Полученный фрагмент (x-cat-lac Z) включается в плазмиду. При этом получается набор плазмид, отличающихся только по фраг­менту х.

• Полученные плазмиды вводят в клетку Е. coli.

• Далее в организм лабораторного животного (мыши) вводят кле­точную суспензию Е. coli и хлорамфеникол.

• Через сутки из слизистой оболочки желудка мыши на твердую индикаторную среду с лактозой высевают бактериальную культуру.

• Затем колонии анализируют. 90% полученных колоний имеет красный цвет (при окислении лактозы меняется рН и соответ­ственно цвет среды); 10% — бесцветные или белого цвета.

Если на индикаторной среде с лактозой выросла бесцветная коло­ния, значит, на искусственной питательной среде данный промотор не работал, и ген во фрагментах «х» не экспрессировался. Вероятно, он нужен только при развитии инфекционного процесса и принад­лежит к генам ivi (генам вирулентности). В случае наличия колоний красного цвета экспрессируется ген, кодирующий образование фер­мента, расщепляющего лактозу, в результате изменяется цвет инди­катора, и колонии окрашиваются в красный цвет.

Используя данный метод, авторы выделили из клеток Е. coli около 100 ivi-генов, из которых 50 были новыми (не описанными ранее) и представляли интерес как потенциальные таргеты для отбора анти­микробных агентов.

 

ЗАДАЧА 34

В основе любого производства фармацевтических препаратов, в том числе и биотехнологического, должна быть заложена …

Вариант ответа

Любое фармацевтическое производство по способу получения целевого продукта подразделяется на химическое, биологическое, химико-энзиматическое, микробиологическое (широко применяется различное сочетание этих методов). Так, D-циклосерин целесообраз­но получать микробиологическим синтезом (продуцентом являются актиномицеты), так как он менее токсичен, чем D-циклосерин, полу­ченный методом органического синтеза. При этом если D-циклосерин активен, то L-циклосерин — нет. Именно поэтому в данном случае приоритет остается за микробиологическим производством, посколь­ку оно, в отличие от химического синтеза, дает гарантии получения только D-циклосерина, обеспечивая тем самым рентабельность про­изводства, терапевтическую активность и безопасность производимо­го препарата. Противоположный пример: получение левомицитина на основе природного продуцента является нецелесообразным, так как активность природного штамма очень низка, а также он весьма капризен по отношению к питательным средам.

Примером выгодного сочетания органического синтеза и биосин­теза является производство аскорбиновой кислоты, в котором этап превращения D-сорбита в L-сорбозу осуществляется уксуснокислы­ми бактериями Gluconobacter oxydans. Или, например, можно привести получение ампициллина и других полусинтетических антибиотиков β-лактамной структуры (оксициллин, карбенициллин, метициллин и др.) из пенициллина (антибиотик, образуемый плесневыми грибами Penicillium chrysogenum). Проведение химического деацилирования бен-зилпенициллина как исходного сырья для получения 6-АПК требует биотрансформации, которая, не разрушая β-лактамного кольца, рас­щепляет именно ту амидную связь, которая необходима для образо­вания 6-АПК. Дальнейший химический синтез ведет к образованию соответствующего радикала (ацилирование 6-АПК). Здесь же можно привести пример преобразования аминогликозидных антибиоти­ков (например, канамицина) с целью получения новых ЛС методом мутасинтеза. Сначала генетики-биотехнологи получают штамм «блок-мутант», который имеет «блок-фермент» по аминоциклитолу. Далее аминоциклитол химически модифицируют и включают в молекулу антибиотика, синтезируемую штаммом «блок-мутантом». Полученные методом мутасинтеза конечные продукты называют мутасинтонами.

ЗАДАЧА 35

Витамины как группа незаменимых органических соединений различной химической природы необходимы любому организму…

Вариант ответа

С помощью биотехнологии производство витаминов стало не только высокорентабельным (не требует дорогостоящего оборудова­ния), но также экологичным (без агрессивных сред) и безвредным

для работающего персонала. Известно, что высокой биологической активностью часто обладают не сами витамины, а их производные — коферменты. Например, для рибофлавина характерно функциони­рование в двух коэнзимных формах: флавиномононуклеотида и флавинадениндинуклеотида. Активным продуцентом рибофлавина является культура дрожжеподобного гриба Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii. Сверхсинтеза рибофлавина достигают при использо­вании мутагенов для нарушения механизма ретроингибирования у продуцентов. Одновременно для активного биосинтеза целевого продукта в питательную среду вносят соевую муку или кукурузный экстракт, сахарозу, карбонат кальция, хлорид натрия, витамины. Кроме того, методами генной инженерии получен рекомбинантный штамм-продуцент (Bacillus subtilis) с повышенной устойчивостью к экзогенной контаминации.

Продуцентом витамина В₁₂ являются пропионовые бактерии, продуктивность которых резко повышается при добавлении в среду предшественника витамина В₁₂ — 5, 6-диметилбензинзимидазола — и использовании мутантных штаммов. Если 5,6-диметилбензимида-зол не добавлять, то вместо витамина В₁₂ синтезируется фактор В (кобинамид) и псевдовитамин В₁₂, которые не обладают терапевти­ческим эффектом.

Продуцентом кофермента НАД являются пекарские дрожжи. Выход НАД значительно увеличивается при добавлении в среду предшественников (аденина и никотинамида). Кроме того, можно повысить проницаемость мембран, обрабатывая клетки микро­организмов ПАВ (поверхностно-активными веществами), например цетилсульфатом натрия и др.

При производстве аскорбиновой кислоты используют биотранс­формацию D-сорбита в L-сорбозу уксуснокислыми бактериями.

В качестве промышленного источника эргостерина применяют дрожжи Saccharomyces cerevisae.

Получение β-каротина возможно микробиологическими мето­дами, однако при этом нужно использовать дорогие среды сложного состава, поэтому более рентабельным является химический синтез.

Преимущества использования биотехнологических методов при производстве витаминов:

• возможность селекции высокоактивных штаммов с применением генной инженерии;

• высокий уровень ферментации;

• применение иммобилизации клеток;

• утилизация отходов, снижение себестоимости и экологичность.

ЗАДАЧА 36

Особенно заметно достоинства биокатализаторов проявляются при модификации пространственной структуры стероидных …

Вариант ответа

Наиболее экономичный источник получения стероидных препара­тов — β-ситостерин, содержащийся в растениях и отходах древесины. В качестве коммерческого источника сырья β-ситостерина используют тростник и хлопковое масло. Диосгенин содержится в растении дио-скорее (это импортное и дорогое сырье). Соласодин содержится в пас­лене дольчатом, растет в Казахстане (также дорогое сырье). При микро­биологической трансформации ситостерина путем окисления боковой цепи стерина мутантными штаммами Mycobacterium vacca образуется 17-кетоандростан. Полученный 17-кетоандростан уже химическими методами превращают в ЛС, например тестостерон и его эфиры — метилтестостерон, оксипрогестерон и др. В этом случае вследствие слабой растворимости стероидов применяют фильтрование культу-ральной жидкости с отделением биомассы и добавлением ацетона с дальнейшей перекристаллизацией концентрата ацетонового раствора.

Ключевым веществом в синтезе гидрокортизона, кортизона и преднизолона служит вещество Рейхштейна, которое биотрансфор-мируется культурой Corynebacterium mediolanum.

Основные реакции биотрансформации. При получении кортизона это 11-α-гидроксилирование с использованием гриба Rhizopus nigricans, дегидрогенизацией кортизона и гидрокортизона с помощью бактерий и актиномицетов можно получать преднизолон. Окисление гидроксильной группы в кетогруппу можно осуществлять при использова­нии бактерий, актиномицетов, грибов. В ферментационных процессах реакция гидролиза эфиров стероидов определяет технологическую специфику их получения, когда высокий процент выхода целевого продукта по субстрату сочетается с низкими затратными показате­лями ферментационного процесса. Повышения растворимости сте­роидов достигают механическим и ультразвуковым измельчением, использованием водорастворимых форм стероидов, образованием растворимых комплексов с циклодекстрином (природный цикличе­ский олигосахарид с гидрофильно/гидрофобными свойствами).

В настоящее время при производстве ЛС стероидной структу­ры активно используют иммобилизацию клеток штаммов-микро­организмов.

ЗАДАЧА 37

Наукоемкое и высокоэффективное биотехнологическое производ­ство, являясь малоэнергозатратным, дает возможность значительно…

Вариант ответа

Ниже перечислены направления совершенствования биотехноло­гического производства.

• Совершенствование технологических параметров биосинтеза: выбор продуцента, замена дефицитных сред на менее дефицит­ные, применение иммобилизации биообъектов.

• Совершенствование методов выделения и очистки, введение мем­бранной технологии.

• Соблюдение правил GMP.

Экологические проблемы биотехнологии: уничтожение твердых отходов (биомассы продуцента), очистка жидких отходов (культуральная жидкость), ликвидация газообразных отходов. Самым при­митивным способом утилизации мицелия после его высушивания является вывоз на городские свалки. Другой способ: мицелий поме­щают в грунтовые ямы на бетонный пол, перемешивают с почвой иоставляют на несколько лет (способ удобный, но нерентабельный).

Более перспективные пути утилизации:

• мицелий можно стерилизовать и затем добавлять в корм сельско­хозяйственных животных;

• можно добавлять его в строительные материалы;

• можно извлекать различные фракции из мицелия, например липидную, используя ее как детергент вместо дефицитного кито­вого жира или синтетических пеногасителей.

Очистка жидких отходов (культуральная жидкость) — это систе­ма, состоящая из нескольких последовательных блоков: первого отстойника с отсосом и аэротенка (железобетонный бассейн с пода­чей воздуха по трубам в его нижней части). На этой стадии 80-90% органических веществ под воздействием микроорганизмов преоб­разуется в «активном иле» аэротенка, 70% которого составляет род Pseudomonas, 20% — род Bacterium (грамположительные палочки), 10% — род Bacillus и грамотрицательные кокки. Интенсивная пода­ча воздуха необходима для увеличения окислительной активности микроорганизмов, входящих в состав «активного ила».

Далее следует второй отстойник для осаждения «активного ила». Затем снова аэротенк и блок доочистки с биофильтрами, где проис­ходит полная деструкция трудноокисляемых соединений штаммами-деструкторами (искусственно созданные генно-инженерные кон­струкции — очень нестойкие микроорганизмы). Коммерческие названия: «Thermobac», «Polibac» и др.

 

ЗАДАЧА 38

Востребованность препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов (нормофлоры, пробиотики)…

Вариант ответа

Пробиотики — живые микроорганизмы и/или вещества микроб­ного либо иного происхождения, оказывающие благоприятные эффекты как на физиологические функции, так и на биохимиче­ские и поведенческие реакции организма хозяина, оптимизируя его микробиологический статус. Технология получения таких препара­тов предполагает наличие штаммов микроорганизмов-симбионтов. Их выделяют из кишечного содержимого здоровых детей и взрослых и идентифицируют. Эти штаммы должны обладать высокой анта­гонистической активностью, способностью прикрепляться к эпите­лию кишечника, не гидролизовать кишечную слизь, не повреждать клетки кишечного эпителия. Штаммы проверяют на патогенность и токсичность in vitro. Наконец, они должны быть технологичны, т.е. хорошо расти и размножаться на искусственных питательных средах. Штаммы также должны быть криорезистентны.

В условиях промышленного производства штаммы рассеивают и получают отдельные колонии, которые пересевают на агаризованные или жидкие питательные среды. В процессе ферментации (несколь­ко часов) получают бактериальную суспензию, добавляют раствор криопротекторов (молоко, желатин, лактоза, сахароза) и разливают в ампулы. Далее следует заморозка в жидком азоте и лиофильная сушка. Режим ферментации периодический. Собирают штаммы в той фазе роста, при которой выживание клеток культуры является наибо­лее стабильным, что обеспечивает последующее длительное хранение препарата и обычно определяется экспериментально. Как правило, это конец экспоненциальной фазы и начало стационарной.

Препараты пробиотиков: колибактерин на основе кишечной палочки; бифидумбактерин на основе штамма Bifidobacterium bifidum; бификол — смесь Bifidobacterium bifidum и Е. coli — и др.

Применение: в педиатрии, в инфекционных клиниках, при дли­тельных кишечных расстройствах, дисбактериозах, при антибиотикотерапии. Стандартизацию препаратов-пробиотиков проводят на соответствие паспортным данным штамма, при этом побочные эффекты должны отсутствовать даже при применении препаратов в избыточных дозах.

ЗАДАЧА 39

Аминокислоты известны как составные элементы белков. Био­логически активными являются только L-стереоизомеры …

Вариант ответа

При получении аминокислот применяют различные методы:

• Биологический метод (гидролиз белоксодержащих субстратов) наиболее дешевый. Однако существуют ограничения по стандар­тизации и по источникам сырья. Также из-за проблемы чистоты препаратов необходима многоступенчатая химическая очистка с частичным разрушением целевых продуктов (триптофан, трео­нин, серии, цистеин и др.).

• Химический синтез: образуется смесь D и L-изомеров, тогда как биологически активными являются только L-изомеры амино­кислот. Такое производство дорого, небезопасно и неэкологично. Тем не менее производство аминоуксусной кислоты (глицина) и метионина данным методом рентабелен (в первом случае из-за отсутствия изомеров, во втором — вследствие равной терапевти­ческой активности изомеров).

• Химико-энзиматический метод проводят в 2 этапа. Сначала химически синтезируют предшественник аминокислоты, напри­мер карбоновую кислоту, а затем осуществляют биотрансформа­цию предшественника ферментами живых клеток. Таким путем можно получать, например, аспарагиновую кислоту на осно­ве фумаровой или фенилаланин на основе коричной кислоты. Однако способ дорогой и сложный.

• Микробиологический метод. Обязательным условием возмож­ности его использования является наличие штаммов-супер­продуцентов аминокислот. В качестве модельных микроорганиз­мов применяют некоторые штаммы Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum.

Критерии отбора биообъектов для создания промышленных штаммов. Прежде всего получение ауксотрофных мутантов, что предполагает использование только тех микроорганизмов, которые имеют раз­ветвленный путь биосинтеза по крайней мере двух аминокислот, образующихся из одного предшественника. Их биосинтез контро­лируется на уровне первого фермента общего участка согласован­ным ингибированием конечными продуктами (ретроингибирование). Кроме того, в селекции продуцентов аминокислот активно применяют методы генной инженерии. Например, при вставке генов треонина в плазмиды для их клонирования значительно повышается количество ферментов, ответственных за биосинтез соответствующей аминокислоты. Особенностью питательных сред является добавление в ограниченном количестве той аминокисло­ты, биосинтез которой блокирован в результате мутагенного воз­действия.

Таким методом получают, в частности, глутаминовую кислоту, лизин, треонин.

ЗАДАЧА 40

Иммунобиотехнология вносит весомый вклад в создание ЛС, профилактических и диагностических препаратов…

 

Вариант ответа

Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов, живых гибридных носителей как иммунобиопрепараты вызывают активную иммунизацию посредством возникновения в организме человека или животного антител, вызывающих блокировку проли­ферации патогенного микроорганизма, что не позволяет развиться заболеванию. Сюда относятся живые и аттенуированные вакцины, получаемые путем культивирования штамма либо в курином эмбрио­не, либо в других культурах животных клеток. Примером дивергент­ной вакцины (с общим протективным антигеном у непатогенного для человека микроорганизма и с патогенным для человека возбудителем инфекции) служит вакцина против натуральной оспы человека, в которой использован непатогенный для человека вирус оспы коров. Кроме того, это и БЦЖ-вакцина (с родственными в антигенном отно­шении микобактериями бычьего типа).

Далее можно отметить рекомбинантные вакцины (выделенный ген вируса вставляют с помощью вектора в дрожжевую клетку или в клетку кишечной палочки), к примеру вакцина против гепатита В.

Кроме того, существуют комбинированные вакцины, в частности АКДС (дифтерийный, столбнячный анатоксины и коклюшные кор­пускулярные антигены).

Неживые вакцины (инактивированные) включают в себя убитые культуры патогенных бактерий или вирусов (цельноклеточные, цельновирусные вакцины) или комплексы из патогенных микро­бов с протективными антигенами (субклеточные, субвирионные вакцины).

В молекулярных вакцинах антиген находится в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность антигенности, т.е. в виде эпитопов, детерминант.

 

ЗАДАЧА 41