Ферменты вирулентности (патогенности)

Субстрат действия – клетки и ткани макроорганизма

13) Хламидии. Особенности размножения

Облигатно-паразитические бактерии, сходные по хим. составу с гр- прокариотами.

Зависимость от клетки хозяина связана с неспособностью хламидий синтезировать АТФ.

Особенность их размножения – цикл развития в клетке, включающий закономерную смену двух разных по морфологическим и биохимическим свойствам форм существования микроорганизмов:

- элементарное тельце

- ретикулярное тельце

Высокоинфекционной, спороподобной, внеклеточной формой является элементарное тельце (ЭТ), и вегетативной, репродуцирующейся, внутриклеточной -ретикулярное тельце (РТ). ЭТ имеет вид сферы диаметром 0,15-0,2 мкм. РТ имеет структуру типичных грамотрицательных бактерий размером около 1 мкм. Цикл развития хламидий осущесвляется в цитоплазматическом включении - фагосоме (вакуоле), куда ЭТ попадают путем стимулирования эндоцитоза. В процессе адсорбции и эндоцитоза участвуют термолабильные эффекторные белковые поверхностные антигены хламидий. ЭТ подавляют фагосомо - лизосомальное слияние и преобразуются при участии главного поверхностного протеина в РТ, которые обладают активным метаболизмом, более крупными размерами и активным бинарным делением. Цикл размножения заканчивается обратным переходом РТ в ЭТ, разрывом мембран включения и ограничивающих мембран клетки хозяина, выходом ЭТ из клеток, далее ЭТ инфицируют новые клетки. Тельца включений выявляются в клетках при помощи световой и иммунолюминесцентной микроскопии.

14) культивирование риккетсий и хламидий. Риккетсии культивируются в желточных мешках куриных эмбрионов, перевиваемых культурах клеток, легких белых мышей. Культивирование риккетсий в куриных эмбрионах осуществляется при температуре 35-36°С и ниже и угнетается при повышении ее более 40°С. Риккетсии идентифицируют в мазках при окраске по Романовскому—Гимзе, Хименесу, Маккиавелло, Здродовскому, в мазках, обработанных флюоресцирующими и энзим-мечеными антителами. Для первичного выделения риккетсий используют преимущественно взрослых самцов морских свинок и взрослых белых, линейных и бестимусных мышей. Культивирование хламидий: Можно размножать только в живых клетках. В желточном мешке развивающихся куриных эмбрионов, организ­ме чувствительных животных и в культуре кле­ток.

15) строение вирусов Просто организованные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и нескольких белков, образующих вокруг неё оболочку — капсид. Примером таких вирусов является вирус табачной мозаики. Его капсид содержит один вид белка с небольшой молекулярной массой. Сложно организованные вирусы имеют дополнительную оболочку —белковую или липопротеиновую; иногда в наружных оболочках сложных вирусов помимо белков содержатся углеводы. Примером сложно организованных вирусов служат возбудители гриппа и герпеса. Их наружная оболочка — это фрагмент ядерной или цитоплазматической мембраны клетки-хозяина, из которой вирус выходит во внеклеточную среду.

16. Основные признаки вирусов: 1) тип и структура нк, кол-во нитей 2) стратегия вирусного генома- особенности воспроизводства вируса при взаимодействии с клеткой 3) морфологические признаки:размер, количество капсомеров, тип симметрии, форма, наличие суперкапсида 4) биофизические свойства 5) антигенные свойства 6) географическое распространение, круг хозяев, тропизм. Классификация вирусов. 1) вирусы с оболочкой. А) ДНК-двунитевые: herpesviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae Б) РНК+-однонитевые вирусы: Coronaviridae, Togaviridae,Flaviviridae В) РНК--однонитевые вирусы: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunjaviridae, Arenaviridae, Filoviridae, Rhabdoviridae Г) РНК-обратнотранскрибирующиеся: Retroviridae. 2) Вирусы без оболочки. А) ДНК-двунитевые вирусы: Adenoviridae, Polymaviridae, Papillomaviridae Б) ДНК-однонитевые вирусы: Parvoviridae, Circinoviridae В) РНК+-однонитевые вирусы:Picornaviridae, Caliciviridae Г) РНК-двунитевые вирусы:Reoviridae.

17. Этапы взаимодействия вирусов с клеткой: 1) Адсорбция вируса на клетке: специфическая, неспецифическая 2) проникновение в клетку: слияние мембран вируса и клетки, эндоцитоз 3) «раздевание» вируса – высвобождение вирусного генома 4) транскрипция 5) трансляция 6) репликация 7) сборка вирусных частиц 8)выход вирусов из клетки

18. Транскрипция и репликация зависит от характера нуклеиновой кислоты. Двунитевые ДНК – репликация в ядре клетки или цитоплазме. Механизм – полуконсервативный. Транскрипция: ДНК – ИРНК – рибосомы – белок. Однонитевые ДНК- репликация в ядре клетки. Комплементарная минус нить – матрица для синтеза геномных плюс нитей. Транскрипция: -нить ДНК – иРНК – рибосомы – белок. РНК – плюсоднонитевые, Транскрипция: иРНК – рибосомы – белок. РНК – минусоднонитевые- имеют в своем составе фермент РНК- зависимую РНК-полимеразу. Транскрипция: РНК – иРНК – рибосомы – белок. Двунитевые РНК(ротавирусы) репликация протекает, как у минус РНК-однонитевых. Особенность в том, что матрицей для синтеза вирусных РНК служат плюс нити. Транскрипция: РНК – ДНК – иРНК – рибосомы – белок.

19.Транскрипция вирусных ДНК и РНК контролируется сложными регуляторными механизмами и, прежде всего, продуктами экспрессии регуляторных генов.Примером некоторых механизмов регуляции экспрессии вирусных геномов, имеющих принципиальное, но не исключительное значение, могут служить аденовирусы.
У аденовирусов имеются несколько транскрипционных единиц. На различных стадиях репликативного цикла имеются «предранние», «ранние», «промежуточные» и «поздние» транскрипционные единицы, которые транскрибируются в разные периоды. Транскрипты, которые образовались особенно в ранней стадии инфекции, считываются полностью на поздней стадии инфекции с образованием ряда длинных транскриптов с различными функциями.Общими закономерностями транскрипции некоторых вирусов с дцДНК-геномом являются: транскрипция ранних и поздних генов с разных цепей ДНК, наличие перекрывающихся генов, разных рамок считывания и интронов.У РНК-вирусов регуляция транскрипции в общем происходит менее сложно, чем у ДНК-вирусов. Временные различия транскрипции разных генов выражены не так отчетливо. У большинства семейств вирусов с оц(+)РНК геномная РНК служит мРНК, и для транскрипции-репликации РНК требуется только образование негативной цепи. Однако для ретровирусов и вирусов с несегментированным негативным РНК-геномом существут другие механизмы регуляции транскрипции.Различные виды мРНК имеют различный период полураспада, что может также служить одним из возможных уровней регуляции вирусной репликации. Первичные РНК-транскрипты, образующиеся на ДНК-геномах в ядре перед выходом в цитоплазму, претерпевают серию посттрансляционных изменений (кэпирование, аденилирование, метилирование, делетирование и сплайсинг)

Репликация вирусных геномов — это матричный комплементарный синтез нуклеиновых кислот, преследующий целью наработку геномных последовательностей для их последующей инкапсидации в вирион. ДНК-геномы реплицируются клеточными или вирусоспецифическими ДНК-полимеразами. РНК-геномы реплицируются вирусоспецифическими РНК-полимеразами, которые также являются и транскриптазами. Репликация вирусных геномов происходит или одновременно с транскрипцией, или эти два процесса разделены во времени. Механизмы репликации вирусных геномов различны и определяются видом генома. Существует три модели репликации — полуконсервативная, консервативная и дисперсная. Консервативная и дисперсная модели репликации нуклеиновых кислот установлены только у вирусов. Полуконсервативная модель предполагает, что после первого раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, другая — синтезируемой заново. По такой схеме репликацируются днДНК-геномы. При реализации консервативной модели репликации одна дочерняя молекула состоит из двух родительских цепей, а другая — из вновь синтезированных цепей. Согласно консервативной модели реплицируются двухнитевые РНК реовирусов. ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся таким образом, неизвестны. Дисперсная модель репликации приводит к образованию молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из фрагментов как родительских цепей, так и вновь синтезированных. Дисперсная модель реализуется на промежуточной стадии репликации онДНК генома парвовирусов. Единицей репликации является так называемый репликон — нуклеотидная последовательность, расположенная между точкой начала репликации (origin) и точкой окончания репликации (terminus). Процесс репликации ДНК разделен на три стадии: инициация цепи, элонгация (удлинение) цепи и терминация

20Культивирование вирусов в культуре клеток.
Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц или других биологических объектов, способны размножаться вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и злокачественно перерожденных тканей, обладающих более активной по сравнению с нормальными клетками взрослого организма способностью к росту и размножению. В зависимости от техники приготовления различают три вида культур клеток: однослойные - клетки, способные прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя; суспензионные - клетки, размножающиеся во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании; органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются ограничено). По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяются на: первичные, способные размножаться только на первых генерациях, тоесть в нескольких пассажах после выделения из тканей; перевиваемые, или стабильные, способные размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок посредством постоянного пассирования; полуперевиваемые, имеющие ограниченную продолжительность жизни (40 - 50 пассажейПриготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчение ткани, разъединение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующем суспендированием клеток в питательной среде.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготавливают из злокачественных или нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Hep - 3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьян и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Для выращивания вирусов можно использовать культуры тканей любого типа. Доза заражения зависит от цели и назначения опыта. Тканевые культуры используют для выделения новых малоизученных вирусов, когда обычным методом (заражение животных, куриных эмбрионов) невозможно установить вирусную природу возбудителя. Выбор клеточных культур определяется их чувствительностью к отдельным группам вирусов.
Различают острую и хроническую инфекции. Острое течение инфекции характеризуется цитопатическим действием (деструктивными изменениями зараженных клеток, завершающихся их гибелью). Хроническая форма репродукции вируса не вызывает быструю гибель клеток, они долгое время остаются жизнеспособными и внешне могут не отличаться от зараженных.
21) Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.. Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании. Недостаткм культив.на кур. эмбр. результате заражения могут происходить и появляться:1) гибель эмбриона;2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов). Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).
Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.
Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.
Индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА.

22. Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Преимущества и недостатки. Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей. Например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных убивают, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются `пассажами'. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено. Преимущество метода культивирования вирусов в организме лабораторных животных перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре клеток или эмбрионе. К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма подопытных животных посторонними вирусами.

23. Методы индикации вирусов при культивировании их на клеточных культурах. Индикацию вирусов в культуре клеток проводят на основании следующих феноменов: Цитопатическое действие (ЦПД) - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до их отторжения от стекла, которые возникают в результате внутриклеточной репродукции вирусов. Вирусные включения - скопление вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Включения различаются по величине, форме, численности. Бляшки, или негативные колонии - ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток, которые вирусы способны образовывать в монослое клеток под агаровым покрытием. Одна бляшка соответствует потомству одного вириона. Бляшкообразование используют для дифференциации, селекции вирусов, для определения их концентрации в исследуемом материале. `Цветная' проба. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и цвета индикатора фенолового красного на желтый. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается, клетки гибнут, и среда сохраняет свой первоначальный (красный) цвет=> красный цвет среды указывает на наличие вируса и прекращение жизнедеятельности клеток. Гемадсорбция - способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроцитыопределенных видов животных и птиц. Гемадсорбция проявляется скоплением в виде гроздей эритроцитов, адсорбированных на инфицированных вирусом клетках. Интерференция -испытуемый вирус вводится в культуру клеток первым, через несколько дней туда же вносят стандартную дозу вируса, обладающего выраженной цитопатической активностью или способностью вызывать гемадсорбцию. Отсутствие в культуре `выявляющего' вируса говорит о наличии испытуемого вируса.

24. Методы индикации вирусов при культивировании их на куриных эмбрионах. Индикацию вирусов в курином эмбрионе осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА. Методы заражения и вскрытия эмбрионов: вируссодержащий материал вводят в количестве 0,1 ― 0,2 мл в амниотическую полость открытым и закрытым способами через проколы в скорлупе и на оболочку, в редких случаях ― в желточный мешок после обработки поверхности яиц 70° спиртом и йодом. Зараженные яйца ставят в штативы отверстием вверх и помещают в термостат. После накопления вируса вскрывают скорлупу, извлекают хорионаллантоисную оболочку, промывают ее в физиологическом растворе, кладут в чашку Петри и просматривают на черном фоне появление специфических изменений. Полученную жидкость используют для исследований с целью выделения вирусов.