Реакции ГНТ появляются через 20-30 мин после повторного попадания аллергена. Реакции ГЗТ появляются через 6 – 8 часов и позже. Различны механизмы ГНТ и ГЗТ. ГНТ связана с выработкой антител (гуморальный ответ), ГЗТ – с клеточными реакциями (клеточный ответ).
Различают ГНТ 3-х типов: I тип – IgE-опосредованные реакции; II тип – цитотоксические реакции; III тип – реакции иммунных комплексов.
Реакции I типа чаще всего вызываются экзоаллергенами и связаны с выработкой IgE. При первичном попадании аллергена в организм, происходит образование IgE, которые обладают цитотропностью и связываются с базофилами и тучными клетками соединительной ткани. Накопление специфичных к данному аллергену антител называется сенсибилизацией. После сенсибилизации (накопления достаточного количества антител) при повторном попадании аллергена, вызвавшего образование этих антител, т.е. IgE, аллерген связывается с IgE, находящимися на поверхности тучных и др. клеток. В результате этого происходит разрушение этих клеток и выделение из них особых веществ - медиаторов (гистамина, серотонина, гепарина). Медиаторы действуют на гладкую мускулатуру кишечника, бронхов, мочевого пузыря (вызывают ее сокращение), кровеносные сосуды (повышают проницаемость стенок) и др. Эти изменения сопровождаются определенными клиническими проявлениями (болезненными состояниями): анафилактический шок, атопические болезни – бронхиальная астма, ринит, дерматит, детская экзема, пищевые и лекарственные аллергии. При анафилактическом шоке наблюдается одышка, удушье, слабость, беспокойство, судороги, непроизвольное мочеиспускание и дефекация.
Для предупреждения анафилактического шока проводят десенсибидизацию для уменьшенияколичества антител в организме. Для этого вводятся малые дозы антигена-аллергена, которые связывают и выводят из циркуляции часть антител. Впервые способ десенсибилизации предложил русский ученый А. Безредка, поэтому он называется способом Безредки. Для этого человеку, который ранее получал антигенный препарат (вакцину, сыворотку, антибиотики), при его повторном введении вначале вводят небольшую дозу (0,01 – 0,1 мл), а через 1 – 1,5 часа – основную дозу.
Реакции II типа вызываются эндоаллергенами и вызваны образованием антител к поверхностным структурам собственных клеток крови и тканей (печени, почек, сердца, мозга). В этих реакциях участвуют IgG, в меньшей степени IgM. Образующиеся антитела связываются с компонентами собственных клеток. В результате образования комплексов антиген-антитело активируется комплемент, что приводит к лизису клеток-мишеней, в данном случае клеток собственного организма. Развиваются аллергические поражения сердца, печени, легких, мозга, кожи и др.
Реакции III типа связаны с длительной циркуляцией в крови иммунных комплексов, т.е. комплексов антиген-антитело. Они вызываются эндо- и экзоаллергенами. В них участвуют IgG и IgM. В норме иммунные комплексы разрушаются фагоцитами. При определенных условиях(например, дефект фагоцитарной системы) иммунные комплексы не разрушаются, накапливаются и длительно циркулируют в крови. Эти комплексы осаждаются на стенках кровеносных сосудов и других органах и тканях. Эти комплексы активируют комплемент, который разрушает стенки сосудов, органы и ткани. В результате развиваются различные заболевания. К ним относятся сывороточная болезнь, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, коллагенозы и др.
Сывороточная болезнь возникает при разовом парентеральном введении больших дозсывороточныхи других белковых препаратов через 10 – 15 дней после введения. К этому времени образуются антитела к белкам сывороточного препарата и образуются комплексы антиген-антитело. Сывороточная болезнь проявляется в виде отека кожи и слизистых оболочек, повышения температуры тела, припухания суставов, сыпи, зуда кожи. Профилактика сывороточной болезни проводится по способу Безредке.
Реакции IV типа – гиперчувствительность замедленного типа. В основе этих реакций лежит клеточный иммунный ответ. Они развиваются через 24 – 48 часов. Механизм этих реакций заключается в накоплении (сенсибилизации) специфических Т-хелперов под влиянием антигена. Т-хелперы выделяют ИЛ-2, который активирует макрофаги, и они разрушают антиген-аллерген. Аллергенами являются возбудители некоторых инфекций (туберкулеза, бруцеллеза, туляремии), гаптены и некоторые белки. Реакции IV типа развиваются при туберкулезе, бруцеллезе, туляремии, сибирской язве и др. Клинически они проявляются в виде воспаления в месте введения аллергена при туберкулиновой реакции, в виде замедленной аллергии к белкам и контактной аллергии.
Туберкулиновая реакция возникает через 5-6 часов после внутрикожного введения туберкулина и достигает максимума через 24 – 48 часов. Выражается эта реакция в виде покраснения, припухлости и уплотнения на месте введения туберкулина. Эта реакция используется для диагностики заболевания туберкулезом и называется аллергической пробой. Такие же аллергические пробы с другими аллергенами используются для диагностики таких заболеваний, как бруцеллез, сибирская язва, туляремия и др.
Замедленная аллергия развивается при сенсибилизации малыми дозами белковых антигенов. Реакция возникает через 5 дней и длится 2-3 недели.
Контактная аллергия развивается при действии низкомолекулярных органических и неорганических веществ, которые в организме соединяются с белками. Она возникает при длительном контакте с химическими веществами: фармацевтическими препаратами, красками, косметическими препаратами. Проявляется в виде дерматитов – поражений поверхностных слоев кожи.
Лекция № 16
Реакции иммунитета.
Реакции иммунитета – это реакции специфического взаимодействия (связывания) антигена и антитела или антигена и сенсибилизированного Т-лимфоцита.
Эти реакции протекают in vitro (в пробирке) и in vivo (в живом организме).
В этих реакциях участвует сыворотка (serum), поэтому они называются серологическими.
Реакции иммунитета используются для диагностики инфекционных заболеваний. При этом неизвестный компонент определяется по известному компоненту, что основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом. Если известно антитело, то можно выявить (обнаружить) неизвестный антиген. Если же известен антиген, то по нему можно обнаружить неизвестные антитела.
Таким образом, реакции иммунитета используются:
1) для серологической диагностики (серодиагностики) заболеваний -обнаружение в сыворотке крови больных людей антител к определенному возбудителю инфекционного заболевания (известному антигену); если в сыворотке крови больного человека присутствуют антитела к какому-либо возбудителю, то именно этот возбудитель и вызвал данное инфекционное заболевание;
2) для серологической идентификации (сероидентификации) микробов -для установления вида возбудителя заболевания при помощи иммунных диагностических сывороток (известных антител); если антитела связывают возбудителя, выделенного от больного человека, то этот микроб идентичен тому, которым иммунизировали животного при получении иммунной диагностической сыворотки.
Реакции иммунитета протекают в 2 фазы:
1) специфическая фаза – соединение активного центра антитела с детерминантной группой антигена с образованием комплексов антиген-антитело; эта фаза протекает быстро, но нет видимого эффекта;
2) неспецифическая фаза – появление видимого эффекта взаимодействия антигена и антитела – выпадение осадка (агглютинация) или помутнение (преципитация), что позволяет увидеть образование комплексов антиген-антитело и сделать вывод о соответствии антигена и антитела друг другу.
К реакциям иммунитета относятся реакция агглютинации (РА), реакция преципитации (РП), реакция связывания комплемента (РСК).
Реакция агглютинации.
Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.
Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации. РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза. РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др.
Компоненты реакции:
1. А нтиген (агглютиноген) – это целые (не разрушенные) микробные или другие клетки (корпускулярный, нерастворимый антиген). Агглютиногены – это взвесь живых или убитых микробных клеток или других каких-либо клеток. Антигены могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестный агглютиноген – это микробная культура, выделенная из организма больного, которую необходимо определить. Известный антиген – диагностикум – диагностический препарат - взвесь убитых микробов известного вида в физиологическом растворе. Эта взвесь мутная (непрозрачная), т.к. микробные клетки не растворяются, а остаются целыми. Известный агглютиноген будет использоваться для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больных.
2. Антитело (агглютинин) – находится в сыворотке крови. Антитела также могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестные антитела, которые нужно определить, находятся в сыворотке крови больного человека. Известные антитела находятся в иммунных диагностических сыворотках, которые называются агглютинирующими сыворотками. Они используются для сероидентификации, т.е. для определения неизвестного антигена – вида микробной культуры.
3. Электролит – 0,9% раствор хлорида натрия.
Получение диагностикума.
Выращенную на скошенном агаре чистую культуру возбудителя известного вида (например, возбудителя брюшного тифа) смывают 3-4 мл изотонического раствора, помещают в стерильную пробирку, каким-либо способом убивают микробы (например, кипячением и определяют густоту (должно быть 3 млрд. микробных клеток в 1 мл). Если микробные клетки убивают высокой температурой, то получают О-диагностикум (О-антиген), если же ее обрабатывают формалином, то получают Н-диагностикум (Н-антиген).
Примеры диагностикумов: сальмонеллезный диагностикум, бруцеллезный диагностикум, туляремийный диагностикум.
Получение агглютинирующих сывороток.
Животным (чаще кроликам) 5 – 7 раз через промежутки времени парентерально вводят в возрастающих дозах микробные диагностикумы (проводят гипериммунизацию), а затем у них отбирают сыворотку крови, в которой содержатся антитела к тем микробам, из которых приготовлен диагностикум. Если иммунизацию проводят О-диагностикумом, то получают О-агглютинирующие сыворотки (содержат О-антитела), если Н-диагностикумом – Н-агглютинирующие сыворотки.
Агглютинирующие сыворотки могут быть неадсорбированными или нативными и адсорбированными.
Неадсорбированные сыворотки содержат групповые антитела к нескольким близкородственным видам микробов.
Адсорбированные сывороткисодержат антитела к одному или нескольким антигенам одного вида микроба. Если сыворотки содержат антитела только к одному антигену, они называются монорецепторными или моновалентными,если к нескольким антигенам – групповымиадсорбированными сыворотками.
Примеры агглютинирующих сывороток: сальмонеллезная монорецепторная Н-агглютинирующая сыворотка, сальмонеллезная групповая адсорбированная О-агглютинирующая сыворотка, противохолерная О-агглютинирующая сыворотка и др.
Титр агглютинирующей сыворотки – наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается реакция агглютинации с антигеном (титр зависит от количества антител в крови: чем больше антител, тем выше титр сыворотки).
Способы постановки РА.
1. Ориентировочная (пластинчатая) РА – проводится на стекле. На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена, капля сыворотки без микробов – контроль антитела, капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Учет результатов реакции проводится по появлению хлопьев агглютината. Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.
2. Развернутая реакция агглютинации – проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности. Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают диагностический титр.
При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, когда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Этот титр и называется диагностическим титром. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках.Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.
Если развернутая реакция агглютинации ставится для сероидентификации, то используют агглютинирующие диагностические сыворотки, разведенные до титра или до половины их титра. РА считается положительной, если агглютинация обнаруживается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки.
Реакция преципитации.
Реакция преципитации (РП)– это осаждение растворимого антигена при действии антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен преципитации) – помутнение (образование мутного кольца или осадка – преципитата).
РП применяют для обнаружения неизвестного антигена при ряде инфекционных заболеваний: при сибирской язве, туляремии, менингите, оспе. В судебной медицине ее используют для определения видовой принадлежности крови, спермы; в санитарно-гигиенических исследованиях – для установления фальсификации пищевых продуктов. РП отличается очень высокой чувствительностью и позволяет обнаружить антиген в разведении 1:1 000 000 и 1: 10 000 000.
Компоненты реакции преципитации.
Антиген (преципитиноген) -это антиген молекулярной природы, находящийся в мелкодисперсном (растворимом) состоянии. Преципитиногены – это различные лизаты или экстракты тканей и др. Преципитиноген отличается от агглютиногена размером частиц антигена. Агглютиноген имеет размеры клеток (это не разрушенные целые клетки), а размеры преципитиногена соизмеримы с размерами молекул (это белки и их комплексы с углеводами или липидами). Раствор преципитиногена прозрачный.
2. Антитела (преципитины) находятся в сыворотке крови человека или в иммунных диагностических преципитирующих сыворотках, которые содержат известные антитела.
3. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.
Получение преципитиногена.
Получаютпутемизмельчения материала и извлечения из него белковых антигенов кипячением или другими способами.
Примеры преципитиногенов: лизаты или экстракты различных органов и тканей, чужеродная сыворотка крови (сыворотка - это раствор, в первую очередь, различных белков), фильтраты бульонных культур микробов, солевые экстракты микробов, аутолизаты и др.
Получение преципитирующих сывороток.
Получают путем гипериммунизации кроликов соответствующими преципитиногенами. Такие сыворотки содержат антитела к тем преципитиногенам, которыми иммунизировали кроликов.
Примеры преципитирующих сывороток: преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (содержит антитела к антигенам возбудителя сибирской язвы), преципитирующая противоменингококковая сыворотка (содержит антитела против антигенов возбудителя менингита) и др.
Титр преципитирующей сыворотки – это наибольшее разведение преципитиногена, при котором сыворотка еще дает реакцию преципитации.
Способы постановки РП.
1. Реакция кольцепреципитации – проводится в специальных преципитационных пробирках (диаметр – 0,4-0,5 см, высота – 7-8 см). В пробирку вносят 0,2 – 0,3 мл преципитирующей сыворотки и по стенке длинным носиком пастеровской пипетки осторожно наслаивают такое же количество преципитиногена. Затем осторожно из горизонтального положения пробирки ставят вертикально.
Учет результатов реакции проводят по появлению белого кольца на границе антиген-антитело. При положительной реакции наблюдается образование такого кольца. В этом случае антиген соответствует антителу и происходит их связывание.
Если в качестве преципитиногена используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, то реакция называется реакцией термокольцепреципитации (например, при диагностике сибирской язвы).
2. Реакция преципитации в геле – проводится в чашках Петри или на предметных стеклах, куда помещают слой агарового геля. При застывании геля в нем вырезают лунки, в которые помещают антигены или антитела, или и то и другое. Различают 2 метода РП в геле:
а) метод простой (радиальной) иммунодиффузии: один из компонентов реакции иммунитета (антиген или антитело) помещают в лунку, а другой компонент – смешивают с агаром; при положительном результате (антиген соответствует антителу) вокруг лунки образуется кольцо преципитата;
б) метод двойной иммунодиффузии: и антитело и антиген помещают в отдельные лунки, они диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу; при положительном результате на месте встрече антитела и антигена образуются линии преципитации.
