править]Систематика бактериофагов

Большое количество выделенных и изученных бактериофагов определяет необходимость их систематизации. Классификация вирусов бактерий претерпевала изменения: основывалась на характеристике хозяина вируса, учитывались серологические, морфологические свойства, а затем строение и физико-химический состав вириона^[12].

В настоящее время согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов бактериофаги, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты разделяют на ДНК- и РНК- содержащие.

По морфологическим характеристикам ДНК-содержащие фаги выделены в следующие семейства: Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Plasmaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Tectiviridae, Microviridae, Inoviridae Plectovirus и Inoviridae Inovirus.

РНК-содержащие: Cystoviridae, Leviviridae^[13].

 

 

31. Процесс взаимодействия вирулентных фагов и чувствительной к ним бактериальной клетки.

 

 

По характеру взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги^[11]. Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла^[8]. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки^[7][14].

Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс — созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц^[15].

Продолжительность этого процесса может составлять от нескольких минут до нескольких часов^[8]. Затем происходит лизис клетки, и освобождаются новые зрелые бактериофаги^[11]. Иногда фаг инициирует лизирующий цикл, что приводит к лизису клетки и освобождению новых фагов. В качестве альтернативы фаг может инициировать лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с генетической системой клетки-хозяина, интегрируясь в хромосому или сохраняясь в виде плазмиды^[8]. Таким образом, вирусный геном реплицируется синхронно с ДНК хозяина и делением клетки, а подобное состояние фага называется профагом. Бактерия, содержащая профаг, становится лизогенной до тех пор, пока при определенных условиях или спонтанно профаг не будет стимулирован на осуществление лизирующего цикла репликации. Переход от лизогении к лизису называется лизогенной индукцией или индукцией профага. На индукцию фага оказывает сильное воздействие состояние клетки хозяина предшествующее индукции, также как наличие питательных веществ и другие условия, имеющие место в момент индукции. Скудные условия для роста способствуют лизогенному пути, тогда как хорошие условия способствуют лизирующей реакции^[8][11][15].

Очень важным свойством бактериофагов является их специфичность: бактериофаги лизируют культуры определенного вида, более того, существуют так называемые типовые бактериофаги, лизирующие варианты внутри вида, хотя встречаются поливалентные бактериофаги, которые паразитируют в бактериях разных видов^[16][17].

Править]Жизненный цикл

Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл.

§ Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.

§ Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.

§ Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты.

§ Деление клетки.

§ Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь.

Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь).

Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели:

§ Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка.

§ Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим.

§ Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200—1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.

 

32. Умеренные бактериофаги. Лизогения и фаговая конверсия.

Умеренные бактериофаги после проникновения в бактерию не разрушают ее, так как ДНК фага встраивается в хромосому бактерий и передается по наследству. Это интегративный тип взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой. Встроенная в хромосому бактерии ДНК бактериофага называется профагом, а бактерия — лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умеренного бактериофага называется лизогенией.
Феномен лизогении широко распространен среди бактерий. Лизогенизация бактерий лежит в основе феномена лизогенной, или фаговой, конверсии, который заключается в изменении фенотипа бактериальной клетки (антигенной характеристики, токсинообразования, чувствительности к другим фагам и т.п.). Например, наличие профага в дифтерийной палочке обусловливает ее способность продуцировать экзотоксин. Под действием ультрафиолетового и ионизирующего излучения, химических и других факторов профаг может превращаться в вирулентную форму, что сопровождается репликацией бактериофагов и лизисом бактерий.

§ Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.

§ Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.

§ Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты.

§ Деление клетки.

§ Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь.

Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь).

Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели:

§ Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка.

§ Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим.

§ Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200—1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.

33. Методы обнаружения бактериофагов.

Обнаружение бактериофага в жидкой питательной среде (метод Аппельмана). Два сосуда (пробирки или колбы) с питательными средами засевают одной и той же культурой микроба, гомологичной искомому фагу. Одновременно с посевом или после 3—4-часового инкубирования в термостате в один из сосудов (опытный) вносят фильтрат фага. Второй сосуд, содержащий питательную среду, засеянную культурой микробов, является контролем. Оба сосуда ставят в термостат при 37 °С и через 24 ч учитывают результаты (по Уварову): возможны следующие варианты. 1. Содержимое опытного сосуда прозрачно, в контроле — помутнение питательной среды: содержание в исследуемом фильтрате бактериофага высокой активности. 2. Менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды: бактериофаг средней активности. 3. Одинаковое помутнение в обоих сосудах - для окончательного заключения об отсутствии бактериофага необходимо произвести дополнительное исследование: высев на плотную питательную среду содержимого опытной и контрольной пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри-шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после 24 ч инкубирования при 37 °С учитывают результаты. Посев из контрольного сосуда дает сплошной рост микробов. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста микробов появляются стерильные пятна — колонии бактериофага.

На плотных питательных средах методом фаготипирования бактерий. Питательную среду (мясо-пептонный агар 1,5%) засевают бульонной культурой бактерий, гомологичных искомому фагу. Для получения сплошного роста 2—3 капли культуры, нанесенные в центре чашки, растирают шпателем равномерно по всей ее площади. Спустя 5—10 мин после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят каплями исследуемый фильтрат. На одной чашке можно поставить несколько проб. Для этого по дну чашки намечают разделение питательной среды на секторы и в каждый сектор вносят по капле фильтрата. После того как жидкость впитается в среду, чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат при 37 °С на 18—24 ч. Учет результатов: доказательством наличия бактериофага служит полное отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом участке мелких стерильных пятен — колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).

Методом Грация. Мясо-пептонный агар 1,5% разливают в чашки Петри в количестве 25—30 мл (первый слой). После застудневания среды - 2 ч для подсыхания. В пробирку с 0,7% расплавленного и остуженного до температуры 45 °С агаром вносят 1 мл исследуемого фильтрата и 0,1 мл густого смыва суточной агаровой культуры, соответствующей искомому фагу. Содержимое пробирок быстро перемешивают, чтобы не произошло застудневания агара, и выливают. в ту же чашку вторым слоем. После застудневания агара посев ставят в термостат при 37 °С. Учет результатов, как правило, возможен через 5—8 ч инкубации в термостате. Присутствие бактериофага определяют по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий.

 

34. Применение фагов для диагностики, лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Принцип получения препаратов-бактериофагов.

Выпускавшиеся бактериофаги сначала были в жидком виде. Их применяли местно, перорально, в полости, внутримышечно, подкожно и внутривенно. Затем были разработаны таблетированные формы. В настоящее время с использованием современных технологий созданы новые формы — концентрат, таблетки, линимент и гель. Жидкий концентрат, очищенный от белкового балласта, обладает большей эффективностью по сравнению с жидкими фагами. Таблетированные бактериофаги с кислотоустойчивым покрытием более удобны для больных и экономичны при транспортировке. Линимент, приготовленный на ланолине и касторовом масле, обеспечивает лучшую сохраняемость бактериофага. Используют монофаги (стафилококковый, стрептококковый, эшерихиозный) и комбинированные, содержащие фаголизаты от 2 до 8 бактерий. Не так давно разработан бактериофаг Enterobacter и проведено его клиническое испытание. Для лечения заболеваний вирусно-бактериальной этиологии создан комплексный биологический препарат «Интерфаг», содержащий интерферон и бактериофаги. +с. 89 в моем учебнике

 

35. Санитарная микробиология. Методы и задачи. Понятие о санитарно-показательных микроорганизмах.

Санитарная микробиология — раздел медицинской микробиологии, изучающий мик­роорганизмы, содержащиеся в окружающей среде и способные оказывать неблагоприятное воздействие на состояние здоровья человека. Она разрабатывает микробиологические; показатели гигиенического нормирования, методы контроля за эффективностью обез­зараживания объектов окружающей среды, а также выявляет в объектах окружающей сре­ды патогенные, условно-патогенные и санитарно-показательные микроорганизмы.
Санитарно-показательные микроорганизмы используют в основном для косвенного опре­деления возможного присутствия в объектах окружающей среды патогенных микроорга­низмов. Их наличие свидетельствует о загряз­нении объекта выделениями человека и жи­вотных, так как они постоянно обитают в тех же органах, что и возбудители заболеваний, и имеют общий путь выделения в окружаю­щую среду. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы ки­шечной палочки — (в группу входят сходные по свойс­твам бактерии родов Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс. Возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями (кокками), постоянно обитаю­щими на слизистой оболочке верхних дыха­тельных путей, выделяющимися в окружаю­щую среду (при кашле, чиханье, разговоре), поэтому в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим основным требованиям:
1. должны обитать только в организме лю­дей или животных и постоянно обнаружи­ваться в их выделениях;
2. не должны размножаться или обитать в почве и воде;
3. сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из ор­ганизма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патоген­ных микробов;
4. их свойства должны быть типичными и легко выявляемыми для их дифференциации;
5. методы их обнаружения и идентифика­ции должны быть простыми, методически и экономически доступными;
6. должны встречаться в окружающей среде в значительно больших количествах, чем па­тогенные микроорганизмы;
7. в окружающей среде не должно быть близ­ко сходных обитателей — микроорганизмов.

36. М-ра воздуха. Методы санитарно-бакт-го контроля. Нормативы.

Микрофлора воздуха. В воздух попа­дают микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Здесь обнаруживаются кокковидные и палоч­ковидные бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы.
Золотистый стафилококк и гемолитические стрептококки являются представителями мик­рофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроор­ганизмами, передающимися воздушно-капель­ным путем. Появление в воздухе спорообразующих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель воз­можного антисанитарного состояния. По эпидемиологическим показаниям в воздухе определяют наличие сальмонелл, микобактерий, вирусов.
Санитарно-гигиеническое состояние воз­духа определяется по следующим микробио­логическим показателям:
1. Общее количество микроорганизмов в 1 м3воздуха (общее микробное число) — коли­чество колоний, выросших при посеве воздуха на питательном агаре в чашке Петри в течение 24 ч при 37 °С, выра­женное в КОЕ;
2. Индекс санитарно-показательных микро­бов— количество золотистого стафилококка и гемолитических стрептококков в 1 м3 воздуха. Эти бактерии - представители м.флоры верхних дых-х путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроор­ганизмами, передающимися воздушно-капель­ным путем. Появление в воздухе спорообразующих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель воз­можного антисанитарного состояния.
Для оценки воздуха лечебных учреждений мож­но использовать данные из официально рекомен­дованных нормативных документов.
Методы, аппаратура. Микробиологический контроль возду­ха проводится с помощью методов естест­венной или принудительной седиментации микробов. Естественная седиментация (по методу Коха) проводится в течение 10 мин путем осаждения микробов на поверхность твердой питательной среды в чашке Петри. Принудительная седиментация микробов осуществляется путем «посева» проб воздуха на питательные среды с помощью специаль­ных приборов (импакторов, импинджеров. фильтров). Импакторы — приборы для принудительного осаждения микробов из воздуха на поверхность питательной среды (прибор Кротова). Импинджеры — приборы, с помощью которых воздух проходит через жидкую питательную среду или изотоничес­кий раствор хлорида натрия.

 

40.Микрофлора человека и ее значение для организма. Биотопы. Понятие об аутохтонных, аллохтонных, резидентных и транзиторных микроорганизмах. Методы определения микрофлоры кожи пальцев рук, зубного налета, зева.

С.137 моего учебника. Далее на примере полости рта.

Аутохтонную флору образуют резидентные (постоянно обитающие) и транзиторные (временно присутствующие) микробы. Последние наиболее часто включают условно-патогенные и патогенные виды и проникают в полость рта прежде всего из окружающей среды; эти микроорганизмы не вегетируют в полости рта и быстро удаляются из неё. Аллохтонные микробы попадают в полость рта из других микробных биотопов (например, из кишечника или носоглотки). Исследование микрофлоры организма человека:

а) микрофлоры кожи: посев отпечатков пальцев на МПА в чашки Петри с последующим макроскопическим и микроскопическим изучением выросших колоний;

б) микрофлоры полости рта: микроскопия мазка из зубного налета, посев слизи из зева методом «кашлевых пластинок» (открытые бактериол. чашки со специальной средой подставляют ко входу в полости рта и носа б-ного и просят его сделать несколько кашлевых толчков через рот или нос) и микроскопическое изучение выросших колоний.

 

43. Генетическая система бактерий. Генофор, плазмиды, транспазоны.

С. 94-98 моего учебника. Генетический материал бактерий.

1.Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали- от родительской клетки- к дочерней. 2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидам и мигрирующими генетическими элементами- транспозонами.

Генофор — носитель генов; термин используют для обозначения хромосом прокариот, генома вирусов, внехромосомных факторов наследственности (плазмид) эукариот и прокариот.

Плазмиды - экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их объединение в одно царство жизни с вирусами связано с наличием ряда общих свойств- отсутствием собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка, саморепликацией генома, абсолютным внутриклеточным паразитизмом. Их выделение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.

1.Среда их обитания- только бактерии (среди вирусов, кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).

2.Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства могут быть только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток. 3.Геном представлен двунитевой ДНК.

4.Плазмиды представляют собой “голые” геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе: - контроль генетического обмена бактерий; - контроль синтеза факторов патогенности; - совершенствование защиты бактерий.

Транспозоны включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т.д.). Транспозоны - самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т.е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

 

44. Оперон. Позитивная и негативная регуляция генетической информации.

Единицей транскрипции у прокариот часто организованы в структуры, называемые оперонами. В состав оперона входят расположенные друг за другом структурные гены, продукты которых обычно участвуют в одном и том же метаболическом пути. Как правило, оперон имеет один набор регуляторных элементов (регуляторный ген, промотор, оператор), что обеспечивает координацию процессов транскрипции генов и синтеза соответствующих белков. Промотор -это участок ДНК, ответственный за связывание с РНКполимеразой. Оператор - участок ДНК, с которым связывается белок-репрессор, мешая РНК-полимеразе начать транскрипцию.

В зависимости от характера взаимодействия оператора и регуляторного белка у прокариот различают два типа регуляции активности генов в опероне: негативную и позитивную. При негативной, или отрицательной, регуляции связывание регуляторного белка с оператором репрессирует работу оперона, а при позитивной -наоборот, активирует его. В свою очередь негативной и позитивной могут быть как индукция, так и репрессия. В случае негативной индукции индуктор делает регуляторный белок неспособным связываться с оператором, и при этом структурные гены транскрибируются как, например, в лактозном опероне. При негативной же репрессии регуляторный белок приобретает свойства репрессора после взаимодействия с корепрессором. Таким корепрессором в триптофановом опероне служит накопленный в клетке триптофан, взаимодействие его с регуляторный белком приводит к подавлению транскрипции. При позитивной, или положительной, индукции под влиянием индуктора регуляторный белок (апоиндуктор) связывается с оператором и помогает РНК-полимеразе начать транскрипцию. В случае же позитивной репрессии корепрессор инактивирует апоиндуктор и тем самым способствует прекращению транскрипции.

46. Генет-я изменчивость бактерий. Мутации их значение. Репарация ДНК.

Наследуемая генетическая изменчивость возникает в результате мутаций и генетических рекомбинаций. Мутации (от лат. mutatio — изменять) — это передаваемые по наследству структурные изменения генов. При мутациях изменяются участки геномов (т. е. наследственного аппарата). Бактериальные мутации могут быть спонтанными (самопроизвольными) и индуцированными (направленными), т. е. появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутагенами (хим. веществами, температурой, излучением и т.д.). В результате бактериальных мутаций могут отмечаться:
* изменение морфологических свойств; изменение культуральных свойств; возникновение у микроорганизмов устойчивости к лек-м препаратам;
* ослабление болезнетворных свойств и др.

Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.

Эксцизионная репарация включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстан-е нормальной структуры молекулы.

Пострепликативная репарация - когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка RecA. Пострепликативная репарация была открыта в клетках E.Coli, не способных выщеплять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.

 

47. Фенотипическая изменчивость бактерий. Значение для практической микробиологии

Для фенотипа характерны появление нитевидных, шаровидных форм штаммов, образование споры, капсулы и атипичная ферментация углеводов. Примером может служить штамм Е. coli с генотипом 1ас +, который синтезирует фермент р-галактозидазу, катализирующий ферментацию лактозы,, но этот генотип проявляется в фенотипе при условии их культивирования на среде с лактозой. Переход типичной формы микробов в атипичные затрудняет микробиологический диагноз болезни.

Впервые сообщения об изменении культуральных свойств микробов появились в работах Поль де Крайфа (1921), наблюдавшего расщепление культуры кроличьей септицемии на вирулентные и авирулентные штаммы. Сущность явления: при рассеве на плотной питательной среде бактериальной культуры из одного типичного штамма в основном появляются два типа колоний, отличающихся друг от друга определенными формами. S-форма (гладкая) является нормальным типом колоний для многих грамотрицательных бактерий, кишечной и других групп; R-форма (шероховатая)―измененный тип колоний. Бактерии кишечно-тифозно-дизентерийной группы вирулентны в S-форме колоний, а в R-форме не обладают вирулентными свойствами. Бактерии чумы, туберкулеза, сибирской язвы вирулентны в R-форме, а бруцеллы ― в S-форме. В условиях культивирования микробов возможен переход от S-формы к R-форме. При этом капсульные бактерии теряют капсулы, лишаются биохимической активности и становятся неполноценными в антигенном отношении, приобретая неспецифические антигены. Подвижные бактерии теряют жгутики.

 

48. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний. ПЦР, ДНК и РНК зондирование.

В большей степени методы индикации НК нашли применение в диагностике вирусных инфекций, хотя существуют и спец системы для индикации некоторых прихотливых бактерий (легионелл, хламидий, энтерококков, микобактерий и др). Наиболее распространены МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ ДНК И РНК (зонды). Принцип: ДНК (и РНК) способны специфически связываться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (РНК), меченых изотопами или ферментами (пероксидаза, ЩФ…). Затем образцы исследуют методом ИФА.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Была предложена в 1983г. Принцип: многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы. ЭТАПЫ: 1.ТЕРМИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 2-хнитевой ДНК на отдельные цепочки (93-95°С в течение 30 секунд). 2.ОХЛАЖДЕНИЕ СРЕДЫ И ВНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ, комплементарных нуклеотидным последовательностям обоих цепочек. Используют синтетические праймеры – олигонуклеиды из 10-20 НКт, взаимодействующих с концами отдельных нитей исходной ДНК. Точнее добавляют 2 праймера (комплиментарны). Взаимодействие праймеров называют ОТЖИГОМ (реакция проходит за 20-60 с при 50-65°С).3. Вносят СПЕЦ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ПОЛИМЕРАЗУ (оптимум 70°С), к/я синтезирует вторичные копии цепей ДНК (ампликоны).4. Полученные 2-хнитчатые ДНК снова подогревают, остужают, вносят праймеры и т.д.

Т.к. полимераза устойчива к воздействию t°С, то нет необходимости постоянно её добавлять. После 30-80 циклов проводят идентификацию ДНК методом электрофореза. Подсчитано, что за 30-40 циклов из 1 матрицы образуется 100.000.000 (100 млн) ампликонов. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести ДНК-гибридизацию. ПЦР – оч чувствительный метод, теоретически достаточно иметь в среде лишь 1 молекулу ДНК.

Для ДИАГНОСТИКИ ИНФ ЗАБ-Й маркёром возбудителя явл его геном. Для амплификации отбирают какой-нибудь УНИКАЛЬНЫЙ ген, наиболее отличающий его от других патогенов.