Денатурация и ренатурация DNA

СИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

Структура нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты представляют линейные полимеры нуклеозидмонофосфатов, то есть полинуклеотиды. Нуклеотиды построены из трех компонентов: пиримидинового или пуринового основания, пентозы и фосфорной кислоты. Нуклеотиды связаны между собой в цепь фосфодиэфирной связью. Она образуется за счет этерификации ОН - группы С-З’ пентозы одного нуклеотида и ОН - группы фосфатного остатка другого нуклеотида. В результате один из концов полинуклеотидной цепи заканчивается свободным фосфатом (Р-конец или 5’-конец). На другом конце цепи имеется неэтерифицированная ОН - группа у С-З’ пентозы (З’ - конец).

Типичный нуклеотид (АМР)

Структура полинуклеотидной цепи

Первичная структура нуклеиновых кислот определяется как последовательность нуклеотидных остатков в полимерной цепи. Многообразие молекул DNA и RNA объясняется их первичной структурой. Как многие другие биополимеры, нуклеиновые кислоты имеют ещё и вторичную структуру, под которой понимают их пространственную организацию.

Вторичная структура

DNA Молекула DNA представляет собой правозакрученную спираль, состоящую из двух полинуклеотидных цепей с антипараллельным ходом. Это означает, что 3’-концу одной цепи соответствует 5’-конец другой цепи и наоборот.

Структура двойной спирали DNA

Остатки оснований направлены внутрь спирали. На один виток спирали приходится 10 пар оснований. Цепи DNA не идентичны, так как нуклеотидный состав их различен, однако первичная структура одной цепи предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи, то есть они комплементарны друг другу. Это связано с существованием комплементарных пар оснований.

Комплементарные пары оснований. *СН₃-группа в тимине (Т) замещается на H в урациле (U).

Физико-химическую основу комплементарности составляют водородные связи, которые могут образоваться только между аденином одной цепи и тимином другой, противоположно направленной цепи (пара А-Т), и аналогично между гуанином и цитозином (пара G-C). Вторичная структура RNA несколько иная. Молекула RNA состоит из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки этой цепи (до 20-30 нуклеотидных пар) могут быть комплементарны между собой и образовывают спиральную структуру за счет связей между аденином и урацилом (пара A-U) и гуанином и цитозином (пара G-C). Между спирализованными участками располагаются одноцепочечные петли. Существует несколько разновидностей RNA: матричная (mRNA), транспортная (tRNA), рибосомная (rRNA). На рисунке приведена структура tRNA, у которой спирализованные участки определяют специфическую пространственную конформацию: фигуру «клеверного листа».

Трехмерная пространственная структура транспортной RNA

Анимация трехмерной пространственной структуры транспортной RNA

tRNA имеет на 3’-конце ССА для связывания аминокислоты, а в средней части молекулы - антикодоновый участок - последовательность нуклеотидов, обеспечивающую взаимодействие tRNA с кодоном mRNA.

Денатурация и ренатурация DNA

Вторичная структура DNA стабилизируется лишь слабыми водородными и гидрофобными связями, следовательно, DNA способна к денатурации (плавлению) при повышении температуры до 80-90^о и ренатурации при последующем охлаждении.

Денатурация и ренатурация DNA

При денатурации двухспиральная молекула DNA разделяется на отдельные цепи. Температура, при которой 50% DNA денатурировано, называется температурой плавления и зависит от качественного состава DNA. Так как пары G-C стабилизированы тремя водородными связями, а пары А-Т только двумя, то чем выше доля G-C пар, тем стабильнее молекула. При денатурации DNA поглощение света при длине волны 260 нм повышается (гиперхромный эффект), что позволяет легко контролировать состояние вторичной структуры DNA. Если раствор денатурированной DNA медленно охлаждать (отжиг), то вновь возникают слабые связи между комплементарными цепями и может получиться спиральная структура, идентичная исходной (нативной). На способности DNA к денатурации и ренатурации основан метод молекулярной гибридизации, который применяют для изучения строения нуклеиновых кислот. Препараты DNA, выделенные из особей, принадлежащих к разным видам, образуют несовершенные гибриды. Спиральная структура получается не по всей длине молекулы. В неспирализированных участках полинуклеотидные цепи не комплементарны друг другу. Следовательно, DNA особей неидентична.

Гибридизация DNA

Нуклеазы

Нуклеиновые кислоты гидролизуются под действием нуклеаз -DNAазы и RNAазы. Гидролиз может быть внеклеточным или внутриклеточным (специфическое функциональное расщепление).

Рестрикционные нуклеазы (рестриктазы)

Бактерии продуцируют набор нуклеаз, которые разрезают нити DNA в определенных сайтах. Эти сайты представляют собой определенную последовательность нуклеотидов, читаемую одинаково в обоих направлениях. Примеры последовательностей, узнаваемых E. coli, Bacillus amyloliquefaciens показаны на рисунке:

Примеры сайтов, узнаваемых рестрикционными нуклеазами

Разные рестриктазы узнают разные последовательности. Рестриктазы бактерий участвуют в защите от чужеродной DNA, но, кроме того, они используются при изучении первичной структуры DNA. Молекула DNA животных и человека имеет огромные размеры: 130 млн. нуклеотидных пар имеют длину около четырех сантиметров. Такие молекулы неудобны для исследования. С помощью набора рестриктаз, узнающих разные последовательности, можно разрезать молекулу DNA на фрагменты желаемой длины, удобной для исследования.