І. Перепишите дыхательную цепь митохондрий (цепь переноса электронов (ЦПЭ)
SH2 (ЦТК, β- окисление) Mатрикс
NAD SH2 (сукцинат)
1/2 O2 H2O
S NADH+Н +
FAD· FeS
E-FMN · FeS КoQ цит.b · FeS цит. c1 цит. c цит. aa3
ІІ. Для усвоения темы необходимо уяснить, что:
- Синтез Н2О в цепи тканевого дыхания является основным источником энергии для реакции синтеза АТФ.
- Запомнить, что процесс образования воды в организме и вне его совершается с выделением 210-230 кдж/моль энергии.
- В организме синтез Н2О происходит при участии электронтранспортной цепи внутренней мембраны митохондрий.
- Часть энергии этого процесса (≈40%) используется для реакции синтеза АТФ.
- Реакция образования Н2О в организме сопряжена с процессом окислительного фосфорилирования (синтез АТФ из АДФ и Н3РО4).
- Усвоить понятие коэффициент фосфорилирования (Р/О). Коэффициент фосфорилирования - это число молекул АТФ, образованных в расчете на 1 атом кислорода, использованного в процессе дыхания.
Задание 1. Напишите схему дыхательной цепи для субстратов пиридинзависимых дегидрогеназ (малат, α-кетоглутарат, изоцитрат). Укажите коэффициент фосфорилирования и пункты сопряжения.
Задание 2. Напишите схему дыхательной цепи для субстратов ФАД-зависимых дегидрогеназ. Укажите коэффициент фосфорилирования. Сколько АТФ будет синтезироваться при окислении 5 моль сукцината.
ІІІ. Укажите на дыхательной цепи места действия ингибиторов дыхания и назовите их.
ІУ. Вопрос: Как изменится потребление кислорода митохондриями при интенсивной физической работе?
Вопрос: Как регулируется температура тела при изменении температуры окружающей среды?
Краткие методические рекомендации к проведению заняття.
На занятии проводится тестовый контроль исходного уровня знаний студентов и его коррекция. Проверяется выполнение домашнего задания. Затем студенты приступают к выполнению лабораторной работы, используя при этом инструкцию.
После выполнения лабораторной работы необходимо оформить протокол,сделать выводы к работе, которые проверяет и контролирует преподаватель.Проводится итоговый тестовый контроль по теме, подводятся итоги работы.
Инструкция к практическому занятию «Иследование окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования».
РАБОТА №1: « Изучение активности малатдегидрогеназы»
Принцип метода: малатдегидрогеназа окисляет яблочную кислоту. В качестве конечного акцептора атомов водорода используется 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИ). Если фермент активен, то окраска ослабевает.
Материальное обеспечение:
фосфатный буфер рН=7,4, раствор яблочной кислоты, раствор 2.6 –ДХФИ, суспензия митохондрий, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:
Содержимое пробирок Контроль Опыт
1. Фосфатный буфер рН=7,4 1,0 мл 1,0 мл
2. Раствор яблочной кислоты (малат) 0,5 0,5
3. Раствор 2,6-ДХФИ 0,5 0,5
4. Суспензия митохондрий - 0,5
5. Прокипяченная суспензия митохондрий 0,5 -
Инкубация при комнатной температуре10 минут.
Результаты (окраска).
ВЫВОДЫ:
РАБОТА №2. Изучение активности сукцинатдегидрогеназы
Принцип метода: Сукцинатдегидрогеназа окисляет янтарную кислоту. Конечным акцептором ионов водорода служит 2,6-ДХФИ. Если фермент активен, окраска исчезает.
Материальное обеспечение:
буферный раствор рН=7,4, сукцинат, раствор 2.6 –ДХФИ, суспензия митохондрий, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:
Содержимое пробирок Контроль Опыт
1. Буферный раствор рН=7,4 1,0 мл 1,0 мл
2. Сукцинат 0,5 0,5
3. Раствор 2,6-ДХФИ 0,5 0,5
4. Суспензия митохондрий - 0,5
5.Прокипяченная суспензия митохондрий 0,5 -
_____________
Инкубация при комнатной температуре 10 минут.
Результаты (окраска).
ВЫВОДЫ:
РАБОТА № 3. Изучение реакций окислительного фосфорилирования
Принцип метода При окислении различных субстратов в дыхательной цепи высвобождается энергия, часть которой используется на реакцию фосфорилирования АДФ неорганическим фосфатом: АДФ + Н3РО4 + энергия = АТФ + Н2О.
Степень окислительного фосфорилирования (энергетическая ценность субстратов) определяется по убыли неорганического фосфата (коэффициент Р/О =1- 3). Используя различные субстраты (яблочная, янтарная, аскорбиновая кислоты) определить степень окислительного фосфорилирования. Содержание фосфорной кислоты определяют в реакции с молибдатом аммония и редуцирующим раствором аскорбиновой кислоты по интенсивности окраски образующейся молибденовой сини.
Материальное обеспечение:
инкубационная смесь, физиологический раствор, раствор яблочной кислоты, раствор янтарной кислоты, раствор аскорбиновой кислоты, суспензия митохондрий, раствор ТХУ, раствор молибдата аммония, редуцирующий раствор Фиске и Субарроу, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 4-х пробирках (контроль и 3 опыт) в соответствиии со схемой постановки:
Содержимое пробирок Контроль О п ы т
________________________________
1 2 3
1. Инкубационная смесь 1,0 1,0 1,0 1,0
2. Физиологический раствор 0,5 - - -
3. Раствор яблочной кислоты - 0,5 - -
4. Раствор янтарной кислоты - - 0,5
5. Раствор аскорбиновой кислоты - - - 0,5
6. Суспензия митохондрий 0,5 0,5 0,5 0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре, затем добавляем:
7. Раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ)1,0 1,0 1,0 1,0
8. Раствор молибдата аммония 0,5 0,5 0,5 0,5
9. Редуцирующий раствор Фиске и
Субарроу 0,5 0,5 0,5 0,5
Инкубация 10 минут.
Результаты (интенсивность окраски по четырехбальной шкале).
Коэффициент Р/О
ВЫВОДЫ:
РАБОТА №4 Изучение влияния 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) на окислительное фосфорилирование.
Принцип метода: 2,4-ДНФ является разобщителем фосфорилирования сопряженного с окислением. Об окислительном фосфорилировании судят по убыли в инкубационной среде неорганического фосфата, который определяется, как описано в работе №3.
Материальное обеспечение: р аствор яблочной кислоты, раствор 2.4 ДНФ, суспензия митохондрий, раствор ТХУ, раствор молибдата аммония, редуцирующий раствор, пипетки, пробирки.
Ход работы:
Работу выполняют в 2-х пробирках (контроль и опыт) в соответствиии со схемой постановки:
Содержимое пробирок Контроль Опыт
1.Раствор яблочной кислоты 0,5 0,5
2.Раствор 2,4-ДНФ - 0,5
3.Суспензия митохондрий 0,5 0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре.
4.Раствор Т Х У 1,0 1,0
5.Раствор молибдата аммония 0,5 0,5
6.Редуцирующий раствор 0,5 0,5
Результаты: (интенсивность окраски).
ВЫВОДЫ:
Подпись преподавателя:
Приложение 1
Г р а ф логической структуры
 |
 |
|
|
 |
