Генна інженерія та її практичне використання в медичній мікробіології
Генна інженерія – сукупність експериментальних методів перенесення генетичного матеріалу з однієї клітини в іншу з метою конструювання молекул ДНК з заданою комбінацією генів і створення біологічних об'єктів з корисними властивостями
Етапи генно-інженерних досліджень:
1.Вибір і вилучення із організму клітин-донорів, що мають корисні властивості, генетичного матеріалу.
2.Фрагментація отриманої ДНК з метою одержання окремих комбінацій генів
3.Введення отриманих фрагментів у вектори (плазміди або бактеріофаги)
4.Введення векторів з рекомбінантною ДНК в клітини мікроорганізмів (трансформація або трансфекція)
5.Аналіз мікробної популяції і виділення штаму рекомбінанта
6.Експлуатація одержаного штаму продуцента:
- мікробіологічний синтез корисних речовин;
- клонуванння рекомбінантних генів для їх наступного закріплення у обраному геномі
Метод генетичної інженерії належить до перспективних при отриманні багатьох білкових біологічних речовин, що являють цінність для медицини. Цим методом отримані: інтерферони, інтерлейкіни, інсулін, гормон росту, тканинний активатор плазміногена, вакцина проти гепатиту В, моноклональні антитіла для попередження відторгнення при пересадки нпрки, діагностичні препарати для виявлення ВІЛ і інші.
За допомогою генної інженерії створюються препарати другого покоління, тобто аналоги природних речовин, що мають більшу ефективність дії.
Механізм імунної відповіді організму. Фази імунної відповіді. Імунологічна пам'ять,ім.. толерантність.
Первинна імунна відповідь (АГ потрапляє вперше):
1.Індуктивна фаза (24-96 годин)
• поглинання та процесінг АГ
• активація Т-хелперів
• активація В-лімфоцитів, їх проліферація
• утворення плазматичних клітин
2.Продуктивна фаза (14 діб)
• синтез Ig M (початок на 4-5 добу, максимум на 7-12)
• синтез Ig G (початок на 7 добу, максимум на 14)
• кількість Ig M i G однакова
• формування Т- і В-лімфоцитів пам’яті
Вторинна імунна відповідь (АГ потрапляє повторно):
1.Індуктивна фаза (5-6 годин)
• кінцева проліферація Т- і В-лімфоцитів пам’яті
2.Продуктивна фаза (14 діб)
• одномоментний синтез Ig M і Ig G
• синтез Ig G в більших титрах (максимум на 3-5 добу)
Імунологічна пам'ять. В імунізованому орг, а також в орг., що перніс інф захвор,але потім втратив здатність зберігати антитіла, під впливом спец і не спец подразників підвищ титр імунологлобулінів в сироватці крові. Кліт пам’яті – це частина довго живучих В і Т-лімф, стимульованих цим антигеном, які після 2-3 поділів переходять у стан спокою.Перебуваючи в орг ці лімф можуть розпізнавати антиген який сенсибілізував і давати імунну відповідь.
Ім толерантність- це відсутність імунної відповіді орг. на певний антиген. Відносно інших антигенів такий орг. може виробляти антитіла і відповідати клітинними імунними р-ми. Ім тол виникає в разі контакту орг. З цим антигеном в ембр періоді(період адаптації). Він може тривати і після народження якщо в орг. є антиген до якого виникла толер.
Види толер:
1) природна - може виникнути як до типових антигенів, так і до ауто антигенів, алергенів, пухл і трансп антигенів.
2) індукована - детермінуєтьсяь деякими лік засобами,які пригнічують вироблення антитіл.
Відповідальні за розвиток ім. толер Т і В-супресори.Антигени,які спричиняють ім. тол,дістали назву толерогенів,ними найчастіше можуть бути сироваткові білки.Толерантний орг. Вважає «своїм» чужорідний матеріал і не відповідає на нього ім. р-ми.
Ім тол може бути втрачена при видаленні АГ, що є в орг., а також при введенні ім. сиров проти антигенів якими була індукована толерантність.
Варіант 2
1. Відкриття Пастера та їх роль в розвитку медичної науки Дженнер провів вакцинацію, але суті її він не зрозумів. Це вдалося французькому вченому Луї Пастеру (1822–1895). З іменем Л. Пастера пов'язаний II період розвитку мікробіології – фізіологічний. Пастер є основоположником наукової мікробіології. Він довів неможливість самозародження життя, запропонував методи стерилізації {повного знищення мікроорганізмів) та пастеризацію (більш м'яку стерилізацію), а також науково обґрунтував роль мікроорганізмів у виникненні захворювань. Л. Пастер довів, що бродіння та гниття спричинюють мікроорганізми, що дозволило іншим ученим, зокрема Лістеру та Пирогову, розробити методи асептики та методи асептики та антисептики. Л. Пастер відкрив анаероби, обґрунтував явище атенуації (ослаблення патологічних властивостей збудника), отримав вакцину проти сибірки та сказу. Л. Пастер зібрав навколо себе блискучу плеяду вчених. Серед них були і наші співвітчизники: 1.1. Мечников, О. М. Безредка, М. Ф. Гамалія, І. Г. Савченко та ін. У цю "золоту" пору мікробіології поряд з іменем Л. Пастера стало ім'я німецького вченого Роберта Коха (1843– 1910) – майстра прикладнихдосліджень. Він зробив неоціненний внесок у мікробіологію:· удосконалив мікробіологічну техніку, застосував імерсійні об'єктиви,· мікрофотографію;· використав анілінові барвники;· запропонував методи виділення чистої культури та щільні живильні середовища;· відкрив збудників туберкульозу (паличку Коха) і холери; довів, що збудником сибірки є В. апігпасіз; · обґрунтував теорію та практику дезінфекції (знищення патогенних мікроорганізмів).Роль мутацій і рекомбінацій у виникненні атипових і лікарсько-стійких форм бактерій.
Мутації – зміни в первинній структурі ДНК клітини, які супроводжуються стійкою стрибкоподібною зміною певної біологічної ознаки і стабільно успадковуються наступними поколіннями.
Генетичні рекомбінації – зміни в генотипі бактерій, які зумовлені передачею фрагменту геному однієї клітини (донор) до іншої (реципієнт), і супроводжуються появою нових ознак у рекомбінанта
Еволюційні зміни ознак, що детермінуються одним геном, можуть виникнути в результаті поєднання мутаційного процесу і рекомбінації. Це поєднання грає найбільшу роль в еволюції бактерій а ткож у виникненні лікарсько-стійких форм бактерій.
Ці процеси сліпі відносно адаптивної цінності рекомбінантів, що утворюються. Він механічно створює як непридатні, так і корисні в адаптивному сенсі типи.
Існує два типи лікарської стійкості бактерій: природна, або природна, і придбана.
Природна лікарська стійкість є видовою ознакою. Вона властива усім представникам цього виду і не залежить від первинного контакту (контактів) з цим антибіотиком, в її основі немає ніяких специфічних механізмів. Набута лікарська резистентність виникає у окремих представників цього виду бактерій тільки в результаті зміни її генома. Можливі два варіанти генетичних змін. Один з них пов'язаний з мутаціями в тих або інших генах бактерійної хромосоми, внаслідок яких продукт гена, що атакується, перестає бути мішенню для цього антибіотика. Це відбувається або внаслідок зміни структури білку, або тому, що він стає недоступним для антибіотика.
У іншому випадку бактерії стають стійкими до антибіотика або навіть відразу до декількох антибіотиків завдяки придбанню додаткових генів, носіями яких є R -плазмиды. Вирішальну роль в поширенні лікарської стійкості, у тому числі множинною, грають R -плазмиды завдяки здатності їх до самопереносу.
Експериментально було доведено, що мутації викликаються дією чинника середовища (наприклад, антибіотика), до якого вони дозволяють адаптуватися. Для перевірки цієї гіпотези був розроблений флуктуаційний тест і метод реплік.
Флуктуаційний тест полягає в тому, що невеликі порції початкової культури бактерій розсіюють в пробірки з рідким середовищем, а після декількох циклів ділень додають в пробірки антибіотик. Потім (без наступних ділень) на чашки Петрі з твердим середовищем висівають стійких до антибіотика бактерій, що вижили. Тест показав. що число стійких колоній з різних пробірок дуже мінливо - в більшості випадків воно невелике (чи нульове), а в деяких випадках дуже високе. Це означає, що мутації, що викликали стійкість до антибіотика, виникали у випадкові моменти часу як до, так і після його дії.
Метод реплік полягає в тому, що з початкової чашки Петрі, де на твердому середовищі ростуть колонії бактерій, робиться відбиток на ворсисту тканину, а потім з тканини бактерії переносяться на декілька інших чашок, де малюнок їх розташування виявляється тим же, що на початковій чашці. Після дії антибіотиком на усіх чашках виживають колонії, розташовані в одних і тих же точках. Висіваючи такі колонії на нові чашки, можна показати, що усі бактерії усередині колонії мають стійкість.
