Искусственный синтез генов

Прогресс биотехнологии в животноводстве в будущем будет определяться развитием генной, клеточной, эмбриогенетической инженерией.

 Генная инженерия это раздел биотехнологии связанный с целенаправленным конструированием в пробирке (in vitro) новых генетических систем, которые способны размножаться в клетке и синтезировать определённый продукт.

   Работы по генной инженерии проводятся на уровне молекул, клеточных элементов (хромосомы, ядра) соматических и половых клеток, на организме находящимся на разных стадиях онтогенеза. Необходимо отметить, что генная инженерия решает следующие задачи:

1. Получение генов путём их синтеза или выделения из клеток.

2. Получение рекомбинативных молекул ДНК.

3. Клонирование генов или генетических структур.

4. Введение в клетку генов или генетических структур и синтез чужеродного белка.

Существуют два способа искусственного синтеза генов вне организма это химический и ферментативный. Впервые химическим способом ген был синтезирован в 1969 году индийским учёным Х.Г. Кораной с сотрудниками, который работал в США. Это был ген аланиновой т-РНК пекарских дрожжей. Он включал в себя 77 пар нуклеотидов, однако при введении этого гена в клетку кишечной палочки или бесклеточную среду он не функционировал (т.е. синтезировал белок), так как не имел регуляторных элементов.

Работа по синтезу генов химическим путём этой группой продолжалась и в 1976 году. Они синтезировали ген супрессорной тирозиновой т-РНК, который имел 126 пар нуклеотидов и был работоспособным и мог при введении в живую кишечную палочку синтезировать белок.

В нашей стране с помощью ферментов химическим путём в 1979 году М.Н. Колосовым и Ю.А. Овчинниковым были синтезированы гены гормонов человека и животных. Химико-ферментативный синтез генов довольно широко применяется в генной инженерии для синтеза мелких генов, которые содержат небольшое число пар нуклеотидов. Для получения генов животных, растений и человека, размер которых составляет 1000-3000 нуклеотидов, то этот метод очень сложен и пока неосуществим.

Темин Г. с сотрудниками в 1970 году обнаружил фермент обратный транскриптазе (ревертаза). С помощью этого фермента могут синтезироваться ДНК, используя в качестве матрицы И-РНК (И-РНК → ДНК). Был открыт ферментативный способ синтеза генов. Этим способом в лабораториях многих стран создали целый ряд новых генов. С помощью ферментативного метода были синтезированы гены, отвечающие за синтез белка глобина, человека, кролика, мыши, утки, голубя, иммуноглобулин мыши, белок хрусталика глаза быка, яичный белок и другие.

 

Выделение генов

Кроме синтеза генов их можно выделять из молекул ДНК находящихся в клетке с помощью трансдуцирующих фагов и ферментов. Есть ферменты, которые действуют только на ДНК и широко используются в генетической инженерии. К этим ферментам относятся рестриктазы, ДНК-лигазы, ревертазы и многие другие. Рестриктазы представляют собой своеобразные ножницы, которые разрезают молекулу ДНК в строго определённых местах на отдельные фрагменты или гены. В настоящее время уже описано более 400 рестриктаз для разных видов микроорганизмов. Для генной инженерии важны те рестриктазы, которые при разрезании молекулы ДНК образуют так называемые мелкие концы. Ферменты лигазы сшивают разрезанные фрагменты молекулы ДНК в единое целое. Ферменты ревертазы способствуют синтезу ДНК на молекуле РНК.

Гены перенесённые в клетку не способны самостоятельно воспроизводить сами себя и передавать потомству этой клетки, но эти трудности можно устранить или преодолеть, если гены предварительно включить в состав генетической структуры, которая обладает собственным аппаратом воспроизведения. Такая структура в генетической инженерии носит название вектор или переносчик. Такими векторами может быть молекула ДНК, которая способна переносить в клетку чужеродный ген, обеспечить его размножение, синтез белкового продукта и иногда внедрится в хромосому. Однако в качестве векторов чаще всего используются бактериальные плазмиды, бактериофаги, вирусы, бактерии и вирусы животных, космиды. Космиды это векторы, которые получены путём объединения небольших фрагментов бактериофага лямда и плазмид.

Плазмиды широко распространены среди бактерий. Бактериальные плазмиды представляют собой небольшую кольцевую молекулу двухнитевой ДНК, размером от 3 до 10тыс. нуклеотидных пар, которая способна самостоятельно существовать и размножаться в бактериальной клетке. Плазмид в бактериальной клетке может быть от одной до несколько штук. Плазмиды содержат гены необходимые для воспроизведения молекулы ДНК и гены устойчивости к антибиотикам, их может быть от одного до трёх генов. Клетки бактерий содержащие плазмиды способны расти на средах в присутствии антибиотиков тетрациклина, ампицилина. По этому признаку легко определить содержит клетка бактериальную плазмиду или нет. ДНК- плазмиды легко выделяются в очищенном виде из бактерий, а выделенную ДНК в любое время можно снова внедрить в бактериальную клетку и она там будет размножаться.

Было установлено, что кольцевая плазмидная ДНК в результате разрезания рестриктазами превращается в линейную молекулу и имеет липкие концы. После разрезания плазмиды происходит вставка в неё чужеродного гена или чужеродного ДНК. В плазмиду можно вставлять фрагменты чужеродного ДНК размером не более 10-15тыс. нуклеотидных пар. Рестриктазы разрезают плазмидную ДНК и чужеродную ДНК на фрагменты, затем оба препарата разрезанной ДНК смешивают друг с другом и обрабатываются лигазой. При этом фрагменты ДНК соединяются и образуется так называемая рекомбинантная плазмида или рекомбинантная молекула ДНК. Рекомбинантная плазмида или рекомбинантная молекула ДНК вводится в бактериальную клетку, которая способна синтезировать чужеродный белок где ген этого белка был перенесён плазмидой.

Размножение в бактериях рекомбинантных ДНК называется клонированием. Бактериальные плазмиды используются только для бактерий, так как они не могут размножаться в клетках животного и человека. У животных и человека в качестве векторов используются различные вирусы.

В настоящее время генная инженерия используется в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в медицине, сельском хозяйстве, ветеринарной практике. Так в медицинской практике на основе генной инженерии проводятся исследования, которые получили название генотерапия. Сущность этих исследований состоит в том чтобы исправить наследственные и другие дефекты путём введения в организм полноценных генов. Генная терапия может вскоре заменить аортокоронарное индуцирование. Речь идёт о том чтобы вводить непосредственно в сердце дополнительные гены, которые способствуют образованию новых сосудов взамен порошённых. До сих пор это делалось хирургическим методом.

Медицинские врачи г. Бостона, США опробовали генную терапию на пациентах, которые страдали не сердечно-сосудистыми заболеваниями, а страдали закупоркой артерий. 20 пациентам был введён аналог человеческого гена, который способствует формированию системы кровообращения. В результате лечения у шестнадцати пациентов сформировались новые сосуды, что способствовало нормализации кровотока в обход закупоренных участков. Таким образом 16 пациентов были избавлены от грозившей их ампутации конечностей. Аналогичные опыты были проведены и на сердце от которых учёные ждут положительных результатов.

Генная инженерия применяется и в клонировании. Клонирование – это воспроизведение точных генетических копий или воспроизведения в потомстве точного генома родителя, т.е. генетического копирования. Под руководством Яна Вилмута в Англии с помощью клонирования была получена овца по кличке Доли. Овца Доли была получена следующим образом: взяли ядро клетки из вымени взрослой овцы и выращивали в лабораторной культуре в течении шести дней, затем из другой овцы взяли неоплодотворённую яйцеклетку и с помощью электрического разряда сплавили с клеткой донора. Затем зародыша поместили в матку третьей овцы, которая служила приёмной матерью. Полученная овца Доли уже дала приплод (потомство). Учёные наблюдают за потомством Доли, будет ли она плодовита.

Генетическая инженерия широко применяется в производстве витаминов, аминокислот, антибиотиков, кормового белка, ферментов, глюкозы, различных вкусовых добавок, органических кислот. Дело в том, что генетическая инженерия позволяет создать микроорганизмы, которые являются сверхпродуценты того или иного продукта. Так как микроорганизмы в тысячу раз растут быстрее, чем растения или животные. Так с помощью генной инженерии были получены микроорганизмы синтезирующие витамин В₂, который используется как добавка в корм скоту. Это позволяет увеличить его производство настолько, что это эквивалентно строительству 4-5 новых заводов, производящих его обычным химическим способом.

Ферменты широко используются в пищевой, химической, фармацевтической промышленности и других отраслях народного хозяйства. Фермент химозин широко используется в сыроделии, без этого фермента нельзя изготовить вкусный сыр. Этот фермент получают из желудка телят, однако его не хватает. Сырную проблему решили в г. Москва, академик РАСХН Л.К. Эрнст и немецкий профессор Готфрид Брем. Было установлено, что фермент химозин не синтезируется химическим путём и животных содержащих сычужный фермент в молоке в природе не существует. Но они вырастили единственную в мире овцу, которая вырабатывает дефицитный фермент химозин с молоком. Для этого они несколько лет овцам вводили ген химозина с пристроенным к нему регулировщиком промотором. Промотор велит гену воспроизводить фермент ни  где попало, а только в одном месте в овечьей молочной железе. Были получены две овцы, у которых ген „шёл” туда, куда его направляли. Однако у одной овцы этот ген не работал, а у второй работал очень интенсивно. И в одном литре овечьего молока находилось фермента химозина около 300 мг, а для получения тонны сыра необходимо всего 1г. химозина. С этой задачей справляется овца за день. Этих овец уже имеется несколько десятков и они являются пионерами нового направления в сыроделии. Учёные считают, что в ближайшее время весь российский сыр будет получен с помощью овечьего химозина, даже часть его будет экспортироваться в другие страны.

Эрнст и Брем методом генной инженерии вывели свинью, которая способна после достижения от 100кг до 160кг исключительно наращивать мясо с тонкими прослойками сала.

В настоящее время разрабатываются методы введения в геном животных генов, отвечающих за синтез определённых веществ (гормонов, ферментов, антител, аминокислот, белков и других веществ). Тем самым мы будем насыщать ими путём биосинтеза продукты животноводства. Наиболее подходящим для этих мероприятий является молочный скот, который способен синтезировать и выводить с молоком огромное количество синтезируемых продуктов. Эти продукты будут влиять на здоровье человека без медицинского вмешательства.

Методами генной инженерии в промышленных условиях были получены инсулин, интерферон, гормон роста человека. Находятся в разработке способы синтеза тимозина, альбумина, разных вакцин, некоторых ферментов, гормона роста с.-х. животных, аминокислот. Важное значение в жизнедеятельности человека имеет гормон инсулин, который вырабатывается клетками поджелудочной железы. Этот гормон поддерживает содержание сахара в крови в пределах нормы. Его нехватка вызывает тяжёлое заболевание – сахарный диабет. Раньше инсулин получали из поджелудочной железы телят, чтобы получить килограмм инсулина необходимо было убить 700 телят. В настоящее время получены методом генной инженерии дрожжи, которые вырабатывают нормальный человеческий инсулин. В настоящее время полностью удовлетворён спрос на человеческий инсулин. Так по заказу учёных в короткие сроки были получены штаммы бактерий и дрожжей, которые синтезировали интерферон и гормон роста человека.

Интерфероны (α, β, γ) – это белки биостимуляторы, активаторы иммунной системы клеток, кроме того они обладают антивирусной активностью, припятствуют размножению раковых клеток, необходимы для борьбы с различными инфекциями.

Гормон роста – он продуцируется клетками передней доли гипофиза. Вес этой доли гипофиза меньше одной десятой грамма, и небольшая часть этих клеток вырабатывает гормон роста. Недостаток этого гормона снижает темп роста и вызывает такое заболевание, как карликовость, а избыток этого гормона вызывает гигантизм. Для недельного лечения человека требуется 7мг очищенного гормона. Создание микробных штаммов с помощью генной инженерии позволяют получать в литре культурной среды до 100мг препарата. Планируется получение гормона роста с/х животных. Применение его в скотоводстве увеличивает скорость роста животных на 10-15%, удой увеличивается на 40%. Учёные США подсчитали, что использование гормона роста позволит увеличить молочную продуктивность коров на 52% и довести годовой удой к 2000 году до 9200кг.