Контроль реакции яичников проводится с целью определения готовности донора к извлечению эмбрионов, а также для ориентировочного определения возможного количества эмбрионов, что дает возможность вести контроль за качеством извлечения и планировать дальнейшую работу. Подсчет желтых тел и фолликулов у доноров проводят непосредственно перед извлечением эмбрионов путем ректальной пальпации яичников. При этом следует учитывать, что полноценное желтое тело представляет собой бугорок грибовидной формы с углублением в центре и твердый на ощупь. Фолликулы не так резко выступают над яичником, округлые по форме. При пальпации чувствуется флюктуация фолликулярной жидкости. У доноров, у которых желтые тела отсутствуют или их насчитывается не более двух, извлечение эмбрионов не производят.
НЕХИРУРГИЧЕСКОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ.
Техника нехирургического извлечения эмбрионов включает предварительную оценку половых органов донора (наличие и подсчет желтых тел на каждом из яичников, определение состояния матки и размеров ее рогов). Эмбрионы извлекают на 7-й день после осеменения суперовулирующих доноров. Перед извлечением эмбрионов животное фиксируют в станке, прямую кишку освобождают от фекальных масс. Наружные половые органы и перениальную область тщательно моют теплой водой с мылом, осушают салфеткой, а затем дезинфицируют специальными аэрозолями. Эпидурально вводят 5 мл 2 % - го раствора новокаина или 3 – 5 мл лигновета, или 3 – 5 мл сильвокаина для предотвращения акта дефекации и снятия напряжения гладкой мускулатуры прямой кишки. Строптивым коровам вводят внутримышечно 10 – 15 мл аминазина с целью снятия стресса.
Катетер, предназначенный для извлечения эмбрионов, должен быть стерильным. Перед употреблением в полость катетера вставляют металлический стилет, жестко соединяют с переходником, защищают санитарным чехлом. Инструмент, готовый к работе орошают аэрозолью «силикон». Раздвигают вульву. Катетер осторожно вводят во влагалище под углом 35 – 40 о таким образом, чтобы он не попал в мочеиспускательный канал. Под ректальным контролем катетер осторожно проводят к шейке матки, прорывают защитный чехол и, осторожно манипулируя шейкой, проводят инструмент в тело матки, направляя его в один из рогов. Дойдя до изгиба рога, отстегивают стилет и извлекают его из катетера на 10 см, затем продвигают катетер за изгиб рога (наиболее оптимальный вариант введения катетера на глубину 15 – 20 см от маточно-трубного сочленения), подают в баллончик 15 – 20 см3 воздуха и определяют его местонахождение в роге, извлекают стилет и присоединяют систему для извлечения эмбрионов. Для этого рог матки поднимают за верхушку, осторожно оттягивают вдоль брюшной полости и слегка массируют. В этот период промывная среда через отверстие в катетере поступает внутрь его и самотеком попадает в стерильный цилиндр для сбора жидкости. Эту процедуру выполняют 8 – 10 раз. Обычно на промывание одного рога матки нужно 500 мл среды. Процесс извлечения эмбрионов контролируется ректально.
После завершения промывания одного рога подают 60 см3 воздуха для полного удаления жидкости из рога и всей системы, выпускают воздух их баллончика, извлекают катетер. Другой стерильный катетер вводят аналогичным образом в противоположный рог матки и процедура повторяется. После промывания рога матки среду передают в стерильный бокс для поиска и оценки качества эмбрионов. Катетер после промывания извлекают до бифуркации, а в полость матки вводят смесь антибиотиков (пенициллин +стрептомицин по 1 млн. МЕ в 30 мл 0,5% - го раствора новокаина или среды Дюльбекко).
Для извлечения эмбрионов нехирургическим методом используют двухканальные катетеры фирмы «Нойштадт» (Германия) и трехканальные фирмы «Кассу» (Франция).
Для работы в условиях фермы БелНИИЖем предложена закрытая система извлечения эмбрионов с использованием двухканальных катетеров разных модификаций. Принцип работы системы в том, что среда для извлечения эмбрионов подается в рог матки одним шприцем, а удаление ее осуществляется самотеком через силиконовую трубку путем открытия специального клапана. При этом увеличивается производительность труда в 1,5 – 2 раза и снижается бактериальная обсемененность промывной среды.
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭМБРИОНОВ, ИХ КРАТКОВРЕМЕННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА.
Оценку биологической полноценности эмбрионов крупного рогатого скота можно проводить несколькими методами: морфологически, с использованием витальных красителей, культивированием. Наибольшее распространение получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации зародышей зависят от того, насколько полно оценена их жизнеспособность. Работу с эмбрионами проводят в стерильных условиях в специальном помещении – боксе при температуре воздуха не ниже 25оС. Стерильность в боксе и предбокснике поддерживается при помощи бактерицидных ламп. Для работы используются заранее подготовленные стерильные посуда, одежда, обувь. Непосредственно перед работой 96%-м этиловым спиртом обрабатывают поверхность рабочих столов и микроскопов. Руки обрабатывают 70%-м раствором спирта.
Качество эмбрионов оценивают в следующей последовательности: после промывания рогов матки коровы – донора флаконы с промывной жидкостью через специальное окошко передаются в бокс. Затем их помещают на неподвижную поверхность для осаждения эмбрионов. Через 20 – 30 мин. с помощью сифона или шприца с длинной иглой аккуратно отсасывают верхний слой жидкости, оставляя 60 – 100 мл с осевшими эмбрионами. Отстой разливают в 2 – 3 чашки Петри (дно чашки предварительно расчерчивают на квадраты 1´1 см для облегчения поиска эмбрионов), затем исследуют под бинокулярной лупой при 15 – 20 кратном увеличении. После просмотра жидкости в одной плоскости необходимо сделать несколько круговых движений чашкой Петри с целью исключения потери эмбрионов, прилипших к боковым стенкам. Обнаруженные эмбрионы стерильной пипеткой переносят в часовые стекла или маленькие чашки Петри (Ø 40 мм) в один мл питательной среды для кратковременного культивирования. В состав среды входят фосфатно-солевой раствор Дюльбекко (можно также использовать среды ТС – 199, Игла, гемогидролизат), 20% эмбриональной сыворотки и антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 50ед/мл стрептомицина или 12мкг/мл гентомицина). После этого эмбрионы оцениваются под микроскопом в проходящем свете при 100 – 120 кратном увеличении. Основными критериями, по которым производится оценка качества эмбрионов, являются: определение стадии их развития, соответствие уровня дробления возрасту от оплодотворения до извлечения, целостность и форма оболочки, размеры бластомеров и связь между ними. Биологически полноценными считаются эмбрионы, имеющие правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежденную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. Пригодные к пересадке эмбрионы на 7 – 8 день после осеменения соответствуют стадиям развития: ранняя и поздняя морула, ранняя и поздняя бластоциста. Для ранней морулы характерно наличие 16 – 32 бластомеров. Бластомеры разной величины, набухшие, перивителлиновое пространство свободно от отдельных бластомеров. У поздней морулы число бластомеров увеличивается до 32 – 64. Краевые бластомеры равной величины, завершено уплотнение между бластомерами, отсутствуют разрывы связей между ними.
Для эмбрионов, полученных от коров – доноров мясных пород характерно наличие несколько ослабленной связи между бластомерами. Эмбриональная масса у морул занимает 60 – 70% перивителлинового пространства, не имеющего других включений.
Для ранней бластоцисты характерно наличие 64 – 130 бластомеров. На этой стадии образуются трофобласт и бластополость. Перивителлиновое пространство еще различается. Поздняя бластоциста имеет более 130 бластомеров с четко выраженной бластополостью. Эмбриобласт локализован и отчетливо виден. Трофобласт непрерывный. Зона пеллюцида утончена. Перивителлиновое пространство отсутствует.
Эмбрионы с асинхронным дроблением, с бластомерами разной величины, с повреждением прозрачной оболочки, с лизисом бластомеров и нарушением связи между ними, а также с агглютинацией (разрушением) цитоплазмы, множественными включениями в перивителлиновом пространстве – не пригодны для трансплантации. Для неоплодотворенной яйцеклетки характерна однородность клеточной массы, округлая форма, отсутствие бластомеров.
Для морфологической оценки качества морул и бластоцист рекомендуется 5 – ти бальная шкала: отличные – эмбрионы сферической формы, стадия развития соответствует возрасту, зародышевые клетки однородные по размеру и цвету; хорошие – эмбрионы соответствуют стадии развития, но имеются небольшие отклонения: неправильная форма, наличие незначительных включений в перивителлиновом пространстве, выделение одного или нескольких бластомеров, увеличение перивителлинового пространства; удовлетворительные – эмбрионы имеют клетки со структурными отклонениями, деформированные бластомеры, в перивителлиновом пространстве мертвые клетки; условно-годные – эмбрионы с деформированной прозрачной оболочкой, частичным разрушением бластомеров, нарушением связи между ними, фрагментацией цитоплазмы, сжатием бластомеров; неудовлетворительные – эмбрионы, отстающие в развитии, со структурными нарушениями, имеющие клетки разного размера, дефекты прозрачной оболочки (сколы, трещины), содержат включения в перивителлиновом пространстве.
Манипуляции с эмбрионами с момента их получения до пересадки или криоконсервации занимают от одного до семи часов. В течение этого времени необходимо создать условия, обеспечивающие сохранение жизнеспособности эмбрионов. Кроме того, продолжение развития зародышей при кратковременном культивировании является дополнительным тестом в их морфологической оценке.
Культивирование эмбрионов поводят в часовых стеклах с 0,5 – 1 мл культуральной среды, помещенных в чашки Петри, в термостате при 37оС во влажной атмосфере и при постоянном составе газовой среды (90% азота, 5% кислорода и 5% углекислого газа). После чего их оценивают на пригодность к пересадке. Эмбрионы, пригодные к эмбриопересадке, помещают в специальные пайетты с помощью микро аспиратора по схеме: среда для культивирования (2,5 – 3,0 см) – воздушный пузырек (0,5 – 0,7 см) – эмбрион со средой (2,0 – 3,0 см) – воздушный пузырек (0,5 – 0,7 см) – среда для культивирования (2,5 – 3,0 см). Пайетта готова для пересадки.
Для транспортировки эмбрионов на большие расстояния их заправляют в пайетты, помещают в специальный контейнер (конструкции Белорусского НИИ животноводства), что обеспечивает их высокую сохранность.
НЕХИРУРГИЧЕСКАЯ ПЕРЕСАДКА ЭМБРИОНОВ.
Нехирургическая пересадка эмбрионов состоит в основном из трех этапов: подготовки реципиентов к пересадке эмбрионов; пересадки, включающей прохождение с помощью специальных катетеров внутренней полости половых органов от преддверия влагалища до верхушки рога матки; строгого контроля за реципиентом до установления стельности или до выявления охоты. Основным критерием эффективности применения метода трансплантации эмбрионов является их приживляемость после нехирургической пересадки. Этот показатель во многом зависит от качества самих эмбрионов, степени синхронности проявления эструса между донором и реципиентом, квалификации специалиста и условий выполнения работы по пересадке.
Нехирургическую пересадку эмбрионов проводят в период диэструса (7 – 8 день). В этот период матка наиболее восприимчива к инфекции. Поэтому при пересадке необходимо строго соблюдать асептику. У реципиента должно быть четко выраженное желтое тело, качество которого определяется непосредственно перед пересадкой и оценивается по трехбалльной шкале: «отличное», «хорошее», «удовлетворительное». Животные, у которых желтые тела отсутствуют или слабо выражены, исключают из числа реципиентов и используют в технологии искусственного осеменения. Отобранных реципиентов фиксируют в специальном станке (конструкция БелНИИЖ), наружные половые органы и перениальную область обмывают теплой водой с мылом, вытирают салфеткой, дезинфицируют специальными аэрозолями (септонекс, денсол и др.) или 70% - ным этанолом, делают сокральную анестезию 2% - ным раствором новокаина (5 мл) и внутримышечную инъекцию миорелаксанта ханегифа (10 мл). Реципиентам с легковозбудимым типом нервной деятельности внутримышечно вводят 2,5% - й раствор аминазина в количестве 10 – 15 мл.
Пересадка эмбрионов выполняется специальными катетерами фирм «Кассу» (Франция) и «Нойштадт» (Германия). Катетеры перед использованием стерилизуются кипячением в течение 30 мин, затем высушиваются и до начала использования хранятся в микробоксе под ультрафиолетовой лампой. Эмбрионы, заправленные в пайетту, помещают в стерильный катетер для пересадки, на который снаружи надевают полиэтиленовый санитарный чехол. Специалист по пересадке эмбрионов рукой в перчатке, увлажненной теплым мыльным раствором, раскрывает у реципиента наружные половые губы, другой рукой вводит катетер во влагалище. Чтобы катетер не попал в мочеиспускательный канал, его сначала продвигают на 10 – 15 см снизу вверх и вперед под углом 35 – 40о, а дальше горизонтально до упора в шейку матки. Санитарный чехол прорывают катетером. Под ректальным контролем катетер продвигают через цервикальный канал. Манипуляции с шейкой матки проводятся осторожно, без резких движений и давления на инструмент. После прохождения цервикального канала катетер вводят в рог матки, на стороне которого имеется хорошо развитое, функционирующее желтое тело. Форма желтого тела должна быть округлой, с четко выраженной на верхушке ямкой в виде грибка. Катетер продвигают как можно ближе к верхушке рога матки, ректально контролируя положение округлой головной части инструмента. Убедившись в правильности расположения инструмента, специалист осторожно выдавливает содержимое пайетты в просвет рога матки. Извлекать катетер из полости матки реципиента необходимо осторожным движением. При повторном использовании инструмента его наружную и внутреннюю поверхность промывают водой, затем 70% - ным этанолом, а остатки спирта смывают раствором Дюльбекко. Катетер стряхивают, остатки влаги удаляют стерильной марлевой салфеткой.
Пересадка эмбрионов должна проводиться быстро и осторожно. Оптимальное время нехирургической пересадки 1 – 2 мин. После пересадки эмбрионов ведется контроль за проявлением охоты у реципиентов. Через 2 – 3 месяца после пересадки животных исследуют на стельность.
КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ ЭМБРИОНОВ.
Использование технологии криоконсервирования зародышей позволяет сохранить ценный эмбриоматериал при отсутствии животных-реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки о максимальной эффективностью.
Технология глубокого замораживания и оттаивания зародышей предусматривает следующие этапы: выбор криопротектора и приготовление криозащитных растворов; качественная оценка зародышей, насыщение их криопротектором; постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей; перенос эмбрионов в жидкий азот и их хранение; оттаивание при определенной температуре; выведение криопротектора из эмбриона; морфологическая оценка зародышей по их пригодности к трансплантации; заправка эмбрионов в пайетты и катетеры; пересадка зародышей реципиентам.
Для криоконсервирования используют свежеполученные эмбрионы только отличного и хорошего качества. Основным условием при этом является сокращение доминимума времени манипуляций с эмбрионами от момента извлечения до замораживания.
Операция по подготовке зигот к криоконсервированию (оценка их жизнеспособности, насыщение эмбрионов криопротектором, заправка в пайетты) проводят в стерильном боксе. Посудой для проводки эмбрионов служат стерильные часовые стекла с лунками и чашки Петри.
Наиболее эффективно замораживание поздних морул и ранних бластоцист в качестве криопротекторов используют 1,4 М и 1,0 М раствор глицерина с 1,2-пропандполом, схемы приготовления которых приведены в таблицах 8 и 9.
Таблица 8.
Схема приготовления растворов глицерина.
| №№ р-ра | Концентрация 1,4 М | Концентрация 1,0 М | ||
| М | Компоненты | М | Компоненты | |
| 1. | 1,4 | 1 мл глицерина+9 мл среды Дюльбекко | 1,0 | 0,7 мл глицерина+9,3 мл среды Дюльбекко |
| 2. | 0,7 | 2 мл 1,4 М р–ра глицерина+2 мл среды Дюльбекко | 0,5 | 1 мл 1,0 М р–ра глицерина 1 мл среды Дюльбекко |
| 3. | 1,05 | 1 мл 1,4 М р–ра глицерина+1мл 0,7 М р–ра глицерина в среде Дюльбекко | 0,75 | 1 мл 1,0 М р–ра глицерина+1мл 0,5 М р–ра глицерина в среде Дюльбекко |
| 4. | 0,35 | 1 мл 0,7 М р–ра глицерина+1 мл среды Дюльбекко | 0,25 | 1 мл 0,5 М р–ра глицерина+1мл среды Дюльбекко |
Таблица 9.
Схема приготовления раствора глицерина в комплексе с 1,2-пропандиолом.
| № п./п. | Концентрация раствора | Компоненты |
| 1. | 10% р–р глицерина+15% р–р 1,2–пропандиола | 0,5 мл глицерина+0,75 мл 1,2–пропадиола+20% р–р фетальной сыворотки теленка до отметки 5 мл |
| 2. | 25% р–р глицерина+25% р-р 1,2–пропандиола | 1,25 мл глицерина+0,75 мл 1,2– пропандиола+20% р–р фетальной сыворотки теленка до отметки 5 мл |
Основой для приготовления является среда Дюльбекко, содержащая 100 ед./мл пенициллина или 12,0 мкг/мл гентомицина и 20% фетальной сыворотки теленка. Насыщение зародышей криопротектором осуществляют поэтапно в возрастающих концентрациях растворов (таблица 10).
Все работы с эмбрионами должны проходится стерильными инструментами с использованием стерильной посуды и оборудования.
Таблица 10.
Технология насыщения эмбрионов разными криопротекторами.
| №№ р - ра | 1,0 М р-р глицерина | 1,4 М р–р глицерина | Глицерин+1,2-пропандиол | |||
| Концентрация | Время экспозиции, мин. | Концентрация компонентов | Время экспозиции, мин. | Концентрация компонентов | Время экспозиции, мин. | |
| 1. | 0,25 | 5 | 0,35 | 5 | 10% р–р глицерина+15% р–р 1,2-пропандиола | 10 |
| 2. | 5 | 5 | 0,7 | 5 | 25% р–р глицерина+25% р-р 1,2-пропандиола | 7 |
| 3. | 5 | 5 | 1,05 | 5 | ||
| 4. | 15 | 15 | 1,4 | 15 | ||
После выдержки в последнем растворе криопротектора эмбрионы с помощью микроаспиратора помещают в пайетты, при заправке которых соблюдают следующие условия: набирают последний раствор глицерина вколичестве 2/5 объема, пузырек воздуха, раствор глицерина с эмбрионом-1/5 объема, пузырек воздуха, раствор глицерина- 2/5 объема. Заправка проводится таким образом, чтобы верхний столбик раствора глицерина смочил пыж пайетты. В одну пайетту заправляют не более 2 эмбрионов. Нижний конец пайетты закрывают пластиковой пробкой, на которой указывают дату извлечения, номер донора, быка-производителя и номер пайетты. Данные заносятся в журнал по замораживанию эмбрионов.
Для замораживания эмбрионов рекомендуется использовать следующие программные замораживатели: ЗЭМ-4 (Украина), Миникул АС-25 (Франция), ЭМБИ-К (Россия). Режимы замораживания даны в инструкциях к замораживающим устройствам.
Соломинки с эмбриоматериалом переносят в камеру для замораживания и включают программу. Снижение температуры происходит автоматически до заданного программой уровня. Затем пайетты переносят в жидкий азот для хранения.
Хранение замороженных эмбрионов осуществляется непосредственно в жидком азоте, в сосуде Дьюара. Используются стандартные канистры для хранения гранул спермы. Для транспортировки эмбрионов в замороженном состоянии применяют сосуды Дьюара емкостью 5 л с аналогичными канистрами.
Для оттаивания замороженных эмбрионов нами предлагается два способа. Первый: оттаивание замороженных пайетт с эмбрионами в водяной бане при t=37оС в течение 10-12 сек. до полного исчезновения льда. Второй: оттаивание пайетт на воздухе при 20°С в течение 10 сек., затем в водяной бане при 25°С также 10 сек. Отогретые пайетты освобождаются от маркерной пробки, верхний конец с пыжом отрезают и ее содержимое помещают на часовое отекло. Под микроскопом проводят подсчет количества оттаянных эмбрионов и предварительную морфологическую оценку. После этого эмбрионы отмывают от криопротектора. Удаление его проводят в 4 этапа в убывающей концентрации (таблица 11).
Таблица 11.
Технология удаления криопротекторов из эмбрионов.
| № р-р | 1,0 М р-р глицерина | 1,4 М р-р глицерина | Глицерин+1,2-пропандиол | |||
| концентрация | время | концентрация | время | концентрация | время | |
| 1. | 1,0 | 10 мин | 1,4 | 10 мин | 25% р-р глицерина+25%р-р пропандиола | 10 мин |
| 2. | 0,75 | 5 мин | 1,05 | 5 мин | 10% р-р глицерина+15%р-р пропандиола | 5 мин |
| 3. | 0,50 | 5 мин | 0,75 | 5 мин | 20% р-р фетальной сыворотки | 5 мин |
| 4. | 0,25 | 5 мин | 0,35 | 5 мин | 20% р-р фетальной сыворотки | 5 мин |
| 5. | 20% р-р фетальной сыворотки | 5 мин | 20% р-р фетальной сыворотки | 5 мин | ||
| 6. | 20% р-р фетальной сыворотки | 5 мин | 20% р-р фетальной сыворотки | 5 мин | ||
После морфологической оценки зародыши заправляют в пайетты и производят пересадку подготовленным реципиентам.
В последнее время эффективным является использование сахарозы для выведения криопротекторов из клеток зародышей, что повышает сохранность и приживляемость эмбрионов. Приготовление такого раствора представлено в таблице 12. После выдержки на воздухе и оттаивания в водяной бане зародыши последовательно помещают в растворы (таблица 13).
Таблица 12.
Схема приготовления криопротектора глицерина с использованием раствора сахарозы.
| № р-ра | Исходные растворы | № р-ра | Рабочие растворы | Время, мин | |
| Компоненты | Компоненты | ||||
| 1. | 1,4 М гли- церин | 1,289 г глицерина+10 мл 20% фет. сыв. в ФСБ | 1. 2. | 1,4 М р-р глицерина 0,7 М глицерин+0,7 М сахароза (исходные р-ры 1 и 2 смешать 1:1) | 5 5 |
| 2. | 1,4 М саха- роза | 4,792 г сахарозы+10 мл 20% фет. сыв. в ФСБ | 3. | 0,7 М р-р сахарозы (исходные р-ры 2 и 3 смешать 1:1) | 5 |
| 3. | 20% фет. сыв. | 8 мл ФСБ+2 мл фет. сыв.+пенициллин (100 ед/мл) | 4. 5. | Исходный р-р №3 Исходный р-р №3 | 5 5 |
Таблица 13.
Технология выведения криопротектора глицерина с использованием сахарозы.
| № р-ра | Компоненты | Время, мин |
| 1. | 1,4 М глицерин | 5 |
| 2. | 0,7 М глицерин+0,7 М сахароза | 5 |
| 3. | 0,7 М сахароза +ФСБ с 20% фетальной сыворотки | 5 |
| 4. | ФСБ с 20% фетальной сыворотки | 5 |
| 5. | ФСБ с 20% фетальной сыворотки | 5 |
После выдержки в последнем растворе эмбрионы оценивают под микроскопом при увеличении в 100-120 раз. Жизнеспособные эмбрионы заправляют в пайетты, затем помещают их в катетер и пересаживают реципиентам. Данные морфологической оценки замороженно-оттаянных эмбрионов и их пересадки заносят в журнал.
ПОДГОТОВКА БОКСА И ИНСТРУМЕНТАРИЯ.
За 1,5-2 часа до извлечения эмбрионов в боксе проводят влажную уборку. Столы, микроскопы, инструменты и другое оборудование обрабатывают 96%-м этанолом. Стерилизацию воздуха проводят бактерицидными лампами в течение I часа. Стеклянную посуду моют под проточной водой моющими средствами, после чего тщательно ополаскивают 5-7 раз дистиллированной водой. Стерилизуют в сушильном шкафу при t=130-200°С в течение 1 часа предварительно завернув в фольгу.
Шприцы, иглы, металлический инструмент стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 30 минут. После просушивания инструмент запаивается в стерильные полиэтиленовые пакеты.
Катетеры для извлечения эмбрионов, силиконовые трубки для оттока среды, пробки тщательно моют моющими средствами, ополаскивают дистиллированной водой, обрабатывают 96%-м этанолом и хранят в стерильных пакетах. Перед работой с эмбрионами руки тщательно обрабатывают 70%-м этанолом. Растворы для извлечения эмбрионов и для работы с ними готовят в боксе над пламенем спиртовки. Для работы в боксе необходим комплект спецодежды. В боксе поддерживается температура 22-25°С.
ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ.
Строгое соблюдение ветеринарно-санитарных требований на всех этапах технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота обеспечивает охрану здоровья доноров и реципиентов, профилактику и предупреждение завозных заболеваний, способствует получению высококачественной эмбриопродукции. Используемые животные должны быть средней упитанности, иметь нормальную половую цикличность, хорошо развитую половую систему, а также отрицательно реагировать на бруцеллез, туберкулез, паратуберкулезный энтерит, хламидозный аборт, лептоспироз, лейкоз, инфекционный ринотрахеит, пустулезный вульвовагинит, вирусную диарею, трихимоноз, кампилобактериоз, паратуберкулез и др. Результаты ветеринарных исследований доноров и реципиентов на инфекционные и гинекологические болезни должны быть указаны в ветеринарном свидетельстве или сертификате. Ежемесячно необходимо проводить клинический осмотр доноров и реципиентов. В производственных помещениях ежедекадно проводят очистку и дезинфекцию.
С целью предупреждения заноса и распространения заразных заболеваний специалист по трансплантации должен выполнять следующее: ежедневно проводить влажную уборку в лаборатории, где готовят инструменты и оборудование для получения, пересадки и криоконсервирования эмбрионов; бокс должен быть простерилизован бактерицидной лампой в течение 30 минут; помещение бокса не реже одного раза в неделю подвергают тщательной уборке (моют полы, стены, протирают мебель 3% раствором перекиси водорода и нейтральными моющими средствами); в боксе работать в белом халате, чепчике или косынке и сменной обуви.
До и после выполнения работ по ректальному исследованию доноров и реципиентов, искусственному осеменению, оценке, криоконсервированию и пересадке эмбрионов обязательно мыть руки с мылом, а затем протирать их ватным или марлевым тампоном, смоченным 70%-ным этанолом. Спецодежду стирать с обязательным кипячением и проглаживанием горячим утюгом. Резиновые сапоги, нарукавники и халаты по окончанию работ регулярно моют и дезинфицируют 2% раствором хлорамина. Среды, гормональные и другие препараты, применяемые для вызывания полиовуляции, синхронизации охоты доноров и реципиентов, получения, криоконсервирования и пересадки эмбрионов, должны отвечать требованиям ГОСТа в соответствии с наставлениями по их применению.
С целью предупреждения переноса инфекции от донора к реципиенту при эмбриопересадках, извлеченные эмбрионы после морфологической оценки обрабатывают 0,25% раствором трипсина при t=37оС в течение 30-60с. Для предотвращения бактериальной контаминации эмбрионов крупного рогатого скота следует использовать антибиотики путем введения их в среды для вымывания, культивирования и замораживания. Обязательно проводить санацию матки донора после вымывания.
Замороженные эмбрионы хранят при температуре –196°С в пайетах. Недопускается преждевременное оттаивание эмбрионов и их повторное замораживание. Деконсервированные эмбрионы следует пересаживать не более чем через час после оттаивания.
УЧЕТ И ОТЧЕТНОСТЬ.
Для контроля за проведением работ на Центрах и пунктах трансплантации эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве лабораторией трансплантации эмбрионов БелНИИЖ совместно со специалистами ААН РБ разработаны специальные формы учета и отчетности с целью постоянного контроля и анализа результатов применения отдельных схем, режимов и методов работы, что позволит повышать ее эффективность в практике животноводства.
При поступлении на Центр или пункт трансплантации на каждого донора и реципиента заводится соответственно оформленная карточка племенного учета установленной формы. Характеристика воспроизводительной способности животного и другие показатели, перечисленные в требованиях при отборе коров-доноров, а также причина выбраковки при использовании выбракованных из основного стада животных, указываются в прилагаемой к племенной карточке пояснительной записке. На используемых быков-производителей также заполняется карточка племенного учета или племсвидетельство. В правом верхнем углу карточек племенного учета отмечают тип крови животного (для генетического контроля происхождения потомства).
На каждого полученного методом трансплантации эмбрионов теленка в день его рождения составляют все необходимые документы: акт на оприходование приплода (форма №95 Сельхозучета); журнал приплода и выращивания молодняка крупного рогатого скота.
Генетический контроль происхождения телят-трансплантантов проводят в возрасте 1-1,5 месяца на основании экспертизы систем групп крови родителей и потомства. На каждого бычка или телочку заполняют соответствующие карточки племенного учета.
На Центрах и пунктах трансплантации эмбрионов ведутся специальные журналы для регистрации и непосредственного учета работ (приложение 1-8).
По итогам работы за год составляется отчет (приложение 10), представляемый в вышестоящие организации.
Приложение 1.
