Преципитирующие свойства иммунных сывороток. Использование преципитации в агаре и применение ее для изучения антигенов и определения токсигенности дифтерийной палочки.

Билет№7

1. Антагонизм среди микробов. Работы И. И. Мечникова в этой области. Микробы – антагонисты как продуценты антибиотиков.

Вирусы Коксаки и ЕСНО. Характеристика их свойств. Состав групп. Методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки и ЕСНО.

Методы микробиологической диагностики туляремии. Аллергическая проба, ее постановка и оценка результатов. Серологические реакции. Специфическая профилактика туляремии.

Антибиотики — вещества природного происхождения, обладающие выраженной биологигеской активностью. Они могут быть получены из микробов, растений, животных тканей и синтетическим путем.

Основными продуцентами антибиотиков служат микроорганизмы, обитающие в почве и воде, где они постоянно вступают между собой в самые разнообразные взаимоотношения. Последние могут быть нейтральными, взаимовыгодными (например, деятельность гнилостных бактерий создает условия для деятельности нитрифицирующих бактерий), но очень часто они являются антагонистическими. И это понятно. Только таким путем в природе могло сложиться сбалансированное сосуществование громадного числа видов живых существ. Антагонистические взаимоотношения между бактериями наблюдал еще Л. Пастер. И. И. Мечников предложил использовать антагонизм между бактериями на пользу человеку. Он, в частности, рекомендовал подавлять активность гнилостных бактерий в кишечнике человека, продукты жизнедеятельности которых, по его мнению, сокращают жизнь человека, молочнокислыми бактериями.

Механизмы микробного антагонизма различны. Они могут быть связаны с конкуренцией за кислород и питательные вещества, с изменением рН среды в сторону, неблагоприятную для конкурента, и т. д.

Одним из универсальных механизмов микробного антагонизма является синтез химических веществ-антибиотиков, которые либо подавляют рост и размножение других видов микроорганизмов (бактериостатическое действие), либо убивают их (бактерицидное действие).

Реакция преципитации и ее варианты

Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитацией называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антигенами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.

Появление преципитата при реакции антиген—антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ролью Fс-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приводит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведенную сыворотку.

Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела — испытуемая сыворотка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген — экстрагированный гаптен или полный гаптен соответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электролитов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция коль- цепреципитации) и преципитация в геле.

Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой растворы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с помощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.

Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципитации. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не допуская перемешивания, раствор антигена. В случае гомологичности антител и ан-тигена на границе между этими растворами быстро, через 3—10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой — антиген — наслаивается на первый в виде раствора. Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций (рис. 73).

Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1 %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5—6 мм — одна в центре чашки, 4—5 — по окружности на расстоянии 1—2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические — раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где создаются их эквивалентные концентрации,

образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных.

Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектро- форез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.

3. Вирусы Коксаки и ЕСНО. Характеристика их свойств. Состав групп. Методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки и ЕСНО. (Бабичев, стр. 350).

Вирусы Коксаки

Вирусы группы Коксаки широко распространены в природе, представлены множеством вариантов. По вирусологическим и эпидемиологическим свойствам они во многом подобны полиовирусам и играют значительную роль в патологии человека. Следует отметить, что вирусы Коксаки являются наиболее кардиотропными из всех энтеровирусов. У 20 – 40 % больных в возрасте до 20 лет Коксаки-инфекция осложняется миокардитом. Вирусы Коксаки представлены двумя группами: группа Коксаки А включает 23 сероварианта (А1 – А22, 24); группа Коксаки В включает 6 серовариантов (В1 – В6).

Вирусы Коксаки группы А вызывают у новорожденных мышей вялый паралич, обусловленный поражением скелетной мускулатуры. В отличие от них, вирусы Коксаки В вызывают у новорожденных мышей поражение центральной нервной системы, а изменения в мышцах выражены слабо. Характерным для инфекции является некроз бурого межлопаточного жира. Кроме того, некоторые серовары Коксаки А (20, 21, 24) и все серовары Коксаки В обладают, в отличие от полиовирусов, гемагглютинирующими свойствами.

Считали также, что вирусы Коксаки А, в отличие от вирусов Коксаки В, не размножаются в культурах клеток человека. Но оказалось, что целый ряд сероваров Коксаки А, как и Коксаки В и полиовирусы, способен размножаться в культурах клеток человека. Вирусы Коксаки А и В могут вызывать у человека помимо полиомиелитоподобных заболеваний, иногда сопровождающихся параличами, и различные другие заболевания со своеобразной клиникой: асептический менингит, эпидемическая миалгия (Борнхольмская болезнь), герпангина, малая болезнь, гастроэнтериты, острые респираторные заболевания, миокардиты (кардиотропность больше выражена у вирусов Коксаки).

Вирусы ЕСНО

В 1951 г. были обнаружены другие вирусы, сходные с полиовирусами и вирусами Коксаки, но отличающиеся отсутствием патогенности для обезьян и новорожденных мышей. В связи с тем что впервые обнаруженные вирусы этой группы были выделены из кишечника человека и обладали цитопатическим действием, но не были связаны ни с какими заболеваниями, их назвали вирусами-сиротками или сокращенно вирусами ЕСНО, что означает: E – enteric; C – cytopathogenic; H – human; O – orphan – сиротка.

В настоящее время группа ECHO насчитывает 32 сероварианта. Значительная часть из них обладает гемагглютинирующими свойствами, и все они хорошо размножаются в культуре клеток обезьян. Некоторые серотипы вирусов ECHO (11, 18, 19) относятся к числу наиболее частых возбудителей кишечных диспепсий человека. Источником Коксаки– и ECHO-инфекций является человек. Заражение вирусами происходит фекально-оральным путем.

Патогенез заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки и ЕСНО, сходен с патогенезом полиомиелита. Входными воротами являются слизистая оболочка носа, глотки, тонкого кишечника, в эпителиальных клетках которых, а также в лимфоидной ткани и происходит размножение этих вирусов.

Сродство к лимфоидной ткани – одна из характерных особенностей этих вирусов. После размножения вирусы проникают в лимфу, а затем в кровь, обусловливая вирусемию и генерализацию инфекции. Дальнейшее развитие болезни зависит от свойств вируса, его тканевого тропизма, а также иммунологического статуса организма. Попадая в ток крови, вирусы гематогенно распространяются по всему организму, избирательно оседая в тех органах и тканях, к которым они обладают тропизмом. Развитие полиомиелитоподобного заболевания или серозного менингита происходит лишь в тех случаях, когда вирус проникает через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему. Однако это происходит далеко не во всех случаях. Нейротропные свойства особенно выражены у вирусов Коксаки А 7, 14, 4, 9, 10 и у вирусов Коксаки В 1 – 5.

В случае возникновения острого серозного менингита у больного могут наблюдаться симптомы не только этой болезни, но и связанные с поражением других органов и систем организма, которыми часто ограничивается данная энтеровирусная инфекция. Поэтому сочетание различных форм энтеровирусных заболеваний у одного и того же больного наблюдается нередко.

В связи с тем что между полиовирусами, вирусами Коксаки и ЕСНО существует большое сходство, они были объединены в один род Enterovirus, и в 1962 г. было предложено обозначать их видовым названием и определенным порядковым номером.

Позднее были выделены еще четыре энтеровируса – 68 – 71. Серотип 70 вызвал вспышку новой болезни – острый геморрагический конъюнктивит. Энтеровирус 71 вызвал в 1978 г. в Болгарии эпидемию полиомиелитоподобного заболевания с летальностью 65 %. Этот же серотип 71 стал причиной крупной вспышки заболевания людей на Тайване, протекавшего с геморрагическим пульмональным шоком, энцефалитом и 20 %-ной летальностью. Всего род энтеровирусов человека включает 68 антигенно различающихся серотипов, в том числе:

– полиовирусы: 1 – 3 (3 серотипа);

– Коксаки А: А1 – А22, А24 (23 серотипа);

– Коксаки В: В1 – В6 (6 серотипов);

– ЕСНО: 1 – 9; 11 – 27; 29 – 34 (32 серотипа);

– энтеровирусы человека: 68 – 71 (4 серотипа).

Методы диагностики энтеровирусных заболеваний. Для диагностики заболеваний, вызываемых энтеровирусами, используют вирусологический метод и различные серологические реакции. При этом следует отметить, что на фоне резкого снижения заболеваемости полиомиелитом наблюдается рост полиомиелитоподобных заболеваний, принимающих иногда характер групповых вспышек. В связи с этим при диагностике полиомиелита необходимо иметь в виду возможность обнаружения вирусов Коксаки и ЕСНО, т. е. исследование необходимо проводить в таких случаях на всю группу энтеровирусов. Для их выделения используют кишечное содержимое, смыв и мазки из зева, реже ликвор или кровь, а в случае смерти больного исследуют кусочки ткани из разных органов.

Исследуемым материалом заражают культуры клеток (полиовирусы, ЕСНО, Коксаки В и некоторые серовары Коксаки А), а также новорожденных мышей (Коксаки А).

Типирование выделенных вирусов осуществляют в реакциях нейтрализации, РТГА, РСК, реакции преципитации, используя эталонные смеси сывороток различных сочетаний. Для выявления антител в сыворотках людей при энтеровирусных инфекциях используют те же серологические реакции (РН, цветные реакции, РТГА, РСК, реакции преципитации), но для этих целей необходимо иметь парные сыворотки от каждого больного (в острый период и через 2 – 3 нед. от начала болезни). Реакции считаются положительными при увеличении титра антител не менее чем в 4 раза. При двух этих методах используют также ИФМ (для обнаружения антител или антигена).

4. Методы микробиологической диагностики туляремии. Аллергическая проба, ее постановка и оценка результатов. Серологические реакции. Специфическая профилактика туляремии. (Бабичев, стр. 453).

Лабораторная диагностика. В связи с полиморфной клинической картиной туляремии в ее диагностике решающее значение имеют лабораторные методы: бактериологический, биологический, серологические реакции и аллергическая проба. Бактериологический метод имеет существенную особенность: выделить возбудителя от больного человека непосредственно не удается. Поэтому исследуемым материалом (пунктат бубона, гной из конъюнктивы, пленка из зева, мокрота, испражнения, кусочки органов из трупов грызунов) вначале заражают подкожно белых мышей или морских свинок, а затем уже делают посев крови или материала из органов для получения чистой культуры, которую идентифицируют по морфологическим, культуральным (не растет на обычных средах) свойствам, по реакции агглютинации со специфической сывороткой и окончательно – биологической пробой на белых мышах.

F. tularensis можно выделить также путем заражения в желточный мешок куриных эмбрионов. Возбудитель легко в нем обнаруживается с помощью метода иммунной флуоресценции. Однако биологические пробы и бактериологические исследования по туляремии возможно проводить только в специальных лабораториях. В обычных клинических условиях для диагностики туляремии применяют только серологические реакции (со 2-й нед. развернутая пробирочная агглютинация, РПГА и др.) и аллергическую пробу с тулярином. Последняя является наиболее ранним методом специфической диагностики. При внутрикожной постановке она бывает положительной с 3 – 5-го дня болезни, при накожной – с 6 – 8-го дня. В природных очагах туляремии для контроля эпизоотий среди грызунов используют РПГА и ее варианты (РНАг, РТПГА), а также ИФМ с целью обнаружения антигенов туляремийной палочки в трупах грызунов, погадках хищных птиц, помете хищников.

Специфическая профилактика. Основным методом предупреждения заболевания людей, проживающих на территории природных очагов туляремии, является вакцинация, осуществляемая с помощью живой (ослабленной) сухой накожной вакцины. Вакцину вводят однократно, иммунитет не менее 5 – 7 лет.