Биосинтез ДНК (репликация): стехиометрия реакции. Субстраты, источники энергии, матрица, ферменты и белки ДНК-репликативного комплекса.

Структура двойной спирали позволяла представить простой механизм реплика­ции ДНК: двойная спираль сначала раскручивается, цепи расходятся, а затем каж­дая одноцепочечная половина молекулы ДНК достраивается до целой, двухцепо-чечной молекулы:

Последовательность нуклеотидов вновь синтезирующихся цепей определяет­ся правилом комплементарности оснований и последовательностью нуклеотидов имеющейся цепи. Иначе говоря, имеющиеся нуклеотидные цепи служат матрицей для синтеза новых цепей; в результате получаются две двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные исходной молекуле.

Такой способ репликации получил название полуконсервативного (в принци­пе возможен и другой механизм — консервативный, при котором вновь синтези­руемая нуклеотидная цепь образуется прямо на двойной спирали ДНК, без ее рас­кручивания). Полуконсервативный механизм репликации ДНК нашел подтверж­дение в экспериментах с клетками кишечной палочки. Культуру Е. coli на протяжении нескольких поколений выращивали на среде, содержащей в каче­стве единственного источника азота ¹⁵NH₄C1. После этого все вещества кле­ток Е. coli, в которые входит азот, содержали не обычный изотоп азота ¹⁴N, a тяжелый ¹⁵N. ДНК с ¹⁵N имеет большую плотность, чем ДНК с ¹⁴N, и это можно обнаружить методом центрифугирования (рис. 4.3). Если культуру, содержащую ¹⁵N-ДНК, пересеять на среду с немеченым азотом (¹⁴NH₄C1), то ДНК клеток пер­вого поколения имеет плотность, промежуточную между плотностями ¹⁵N-ДНК и ¹⁴N-ДНК; в клетках второго поколения обнаруживается два типа ДНК: с про­межуточной плотностью и легкая (¹⁴N-ДНК). Эти результаты легко объясня­ются, если исходить из полуконсервативного механизма репликации ДНК. Позднее было

установлено, что в клетках эукариот репликация ДНК происходит также полуконсервативным способом.

Синтез новых полинуклеотидных цепей при репликации катализирует фермент ДНК-полимераза. Реакцию удается

осуществить и изучать in vitro, используя фер­менты, выделенные из организма. Ее можно представить такой схемой:

m (дАТФ + дТТФ) + n (дГТФ + дЦТФ) ------------► ДНК + (m+n) Н₄Р₂0₇

Отметим важнейшие особенности реакции.

1. Субстратами служат трифосфаты дезоксирибонуклеозидов. В ходе реакции от каждого из них отщепляется пирофосфатный остаток; таким образом, включение каждого мономера в молекулу ДНК требует расхода энергии высокоэнергетических связей.

2. Реакция идет только в присутствии уже готовой ДНК, выполняющей роль матрицы. Все вновь синтезируемые молекулы ДНК имеют первичную струк­туру, идентичную первичной структуре ДНК-матрицы.

3. Поскольку в молекуле ДНК нуклеотидные остатки образуют пары А—Т и G—С, в реакции расходуются одинаковые количества дАТФ и дТТФ (стехиометрический коэффициент т) и одинаковые количества дГТФ и дЦТФ (стехиометрический коэффициент п).

ДНК-полимераза не способна начинать синтез новой цепи с ее первого нукле-отида; она может лишь удлинять уже имеющуюся цепь, присоединяя к ее З'-концу новые нуклеотиды. Поэтому для начала реакции требуется затравка (праймер).

При проведении реакции in vitro в качестве затравки обычно используют короткий олигонуклеотид (5-10 нуклеотидных остатков), ком­плементарный матричной цепи ДНК; в живой клетке затравками служат короткие РНК (см. ниже).

Фермент присоединяется к ДНК-матрице и к затравке в области З'-концевого нуклеоти-да затравки. Перемещаясь по матри­це в направлении ее 5'-конца, ДНК-полимера-за удлиняет затравку, присоединяя к ней один за другим нуклеотидные остатки. Очередной нуклеотид растущей цепи должен быть комп­лементарен очередному нуклеотиду матрицы. К активному центру ДНК-полимеразы может присоединяться любой из четырех дНТФ. Но фосфодиэфирная связь образуется лишь в том

случае, если предыдущий нуклеотид растущей цепи комплементарен соответству­ющему нуклеотиду матрицы и соединен с ним водородными связями. Иногда слу­чается ошибка, и фосфодиэфирная связь образуется с нуклеотидом, некомплемен­тарным очередному нуклеотиду матрицы (например, в той фазе, которая пред­ставлена на рис. 4.4, вместо дГТФ используется дАТФ). В этом случае дальнейший рост новой цепи возобновляется лишь после того, как неправильный нуклеотид отщепляется той же ДНК-полимеразой. Таким образом, точность копирования проверяется дважды и поэтому очень высока: на миллиард нуклеотидов только один ошибочный.