Ренативация ДНК Гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.

Особенностью нуклеотидного состава ДНК является то, что число адениловых нуклеотидов равно числу тимидиловых, а число гуаниловых нуклеотидов равно числу цитидиловых: А = Т, G = С; следовательно, A + G = T + C, т. е. число пурино-вых нуклеотидов равно числу пиримидиновых (правила Чаргаффа). Такие соот­ношения не свойственны РНК.

Исходя из правил Чаргаффа о нуклеотидном составе ДНК и из рентгеноструктурных исследований, Дж. Уотсон и Ф. Крик (Великобритания) предложили модель строения ДНК (1953 г.). Ниже сформулированы основные черты этой модели.

1. Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепей, ориентирован­ных антипараллельно и на всем протяжении связанных друг с другом водо­родными связями (каждый из мононуклеотидов участвует в образовании водородных связей).

2. Водородные связи между цепями образуются за счет специфического взаи­модействия аденинового остатка одной цепи с тиминовым остатком другой цепи (пара А»»»Т) и гуанинового остатка одной цепи с цитозиновым остат­ком другой цепи (пара G»»»C).

Основания, образующие пару, комплементарны друг другу в том смысле, что между ними легче возникают водородные связи, чем при других сочетани­ях (например, А и G, А и С и др.); это объясняется геометрией расположе­ния групп, участвующих в образовании водородных связей между парами оснований, и геометрией молекулы ДНК в целом. 3. Первичная структура одной цепи молекулы ДНК комплементарна первичной структуре другой цепи.

Если в положении п (считая с 5'-конца) первой цепи находится остаток дезоксиа-дениловой кислоты (А), то в положении п (считая с З'-конца) второй цепи находится комплементарный ему остаток тимидило-вой кислоты (Т), а не какой-либо иной мо­номер. Таким образом, если известна пер­вичная структура одной цепи молекулы ДНК, то первичная структура другой цепи легко может быть написана исходя из пра­вил комплементарности оснований и ком-плементарности цепей. Следует отметить, что комплементарность цепей не означает идентичности их пер­вичных структур: например, в приведен­ной выше молекуле первая цепь содержит три остатка тимидиловой кислоты, а вто­рая — только два; в первой цепи есть трой­ка нуклеотидов с последовательностью С— Т—С, а во второй цепи такой тройки нет. 4. Обе цепи закручены в спираль, имеющую общую ось; цепи могут быть разделены только путем раскручивания (такие спира­ли называют плектонемическими). Пуриновые и пиримидиновые основания нукле­отидов обращены внутрь спирали.

Плоскости оснований перпенди­кулярны к оси спирали и параллельны друг другу, так что получается стопка основа­ний. Между основаниями в этой стопке возникают гидрофобные взаимодействия, вносящие основной вклад в стабилизацию двойной спирали, больший, чем водород­ные связи между цепями. Рибозофосфат-ные части располагаются по периферии, образуя ковалентный остов спирали.

Денатурация и ренативация ДНК

Вторичная структура нуклеиновых кислот образуется за счет возникновения водо­родных и гидрофобных связей между основаниями, т. е. слабых взаимодействий.

Поэтому, как и в случае белков, возможна денатурация нуклеиновых кислот при умеренных воздействиях.

Денатурация ДНК происходит при нагревании раствора до 70-100 °С, а также в сильнокислой или щелочной средах, или в растворе мочевины. В результате раз­рушения водородных и гидрофобных связей цепи расходятся и принимают конфор-мацию беспорядочного клубка. Температура денатурации зависит от состава ДНК: чем больше в ДНК нуклеотидных пар ГЦ, тем выше температура денатурации.

Денатурация данного образца ДНК происходит в довольно узком интервале тем­ператур, поэтому ее часто называют плавлением. Денатурация сопровождается увеличением поглощения при 260 нм (т. н. гиперхромный эффект). Поглощение может увеличиться примерно в 1,5 раза. Это дает удобный метод наблюдения за ходом денатурации. Денатурацию можно обнаружить также по уменьшению вязкости раствора.

Относительное поглощение — это отношение поглощения УФ-излучения ра­створом ДНК при комнатной температуре к поглощению при температурах, ука­занных на графике.

Если раствор ДНК, денатурированной нагреванием, охлаждать, то вновь воз­никают слабые связи, и при определенных условиях могут получиться двуспиральные структуры, идентичные структурам исходного (до денатурации) препарата; т. е. произойдет ренативация (отжиг ДНК). На явлениях денатурации и ренатива-ции основан метод молекулярной гибридизации, который применяют для изуче­ния строения нуклеиновых кислот, а также для их фракционирования.

Гибридизация ДНК-ДНК

Если смешать растворы ДНК, выделенных из организмов разных видов (напри­мер, лягушки и кролика), нагреть эту смесь (т. е. денатурировать ДНК), а затем охладить, то вновь будут возникать двуспиральные структуры. При этом наряду с двуспиральными молекулами, идентичными исходным молекулам ДНК, могут об­разовываться гибридные молекулы, содержащие одну нуклеотидную цепь из ДНК лягушки, а другую — из ДНК кролика. Такие гибридные молекулы быва­ют несовершенными: спирализованные участки чередуются в них с неспирализованными; очевидно, в неспирализующихся участках полинуклеотидные цепи не комплементарны друг другу. Несовершенство гибридов ДНК-ДНК можно обнару­жить с помощью электронного микроскопа. Изучение гибридизации ДНК-ДНК позволило сделать следующие важные для биологии выводы:

1. ДНК клеток всех органов и тканей одного и того же организма идентичны.

2. ДНК, выделенные из тканей разных особей одного биологического вида, идентичны (точнее — почти идентичны).

3. ДНК, полученные от особей разных биологических видов, неидентичны, образуют несовершенные гибридные молекулы. Степень несовершен­ства гибридов ДНК-ДНК тем больше, чем отдаленнее филогенетическое родство между видами. Иначе говоря, первичная структура ДНК харак­теризуется видовой специфичностью. В связи с этим метод гибридиза­ции ДНК-ДНК оказалось возможным применять для уточнения система­тики организмов.

Гибридизация ДНК-РНК

Сходным образом может происходить и гибридизация ДНК-РНК: в этом случае гибридная молекула содержит одну дезоксирибонуклеотидную цепь и одну рибо-нуклеотидную. Из результатов гибридизации следует, что каждая

молекуда РНК (точнее — первичный транскрипт) комплементарна опре­деленному участку ДНК того же организма. Это означает, что все соображения относительно видовой специфичности ДНК в равной мере применимы и к РНК.