у бактерий: трансдукция
Цель работы: изучить способы переноса генетического материала в бактериальную клетку методом трансдукции.
Материалы и оборудование: фаголизат E. coli lac+, культура E. coli lac-, стерильные пробирки, автоматические пипетки со стерильными наконечниками, спиртовки, чашки Петри со средой Эндо, термостат.
Основные положения
Фаговая инфекция может служить механизмом обмена генетическим материалом между бактериями. Трансдукция – перенос генетического материала от одной бактериальной клетки к другой посредством бактериофага (рис. 40).
Выделяют 3 типа трансдукции:
- неспецифическая трансдукция: передача различных фрагментов ДНК от бактерии – донора к реципиентам с помощью фагов. Фрагмент включается в гомологическую область ДНК в реципиенте при рекомбинации.
- специфическая трансдукция: фаги переносят только определенные гены, т.к. ДНК фага соединяется со строго определенными бактериальными генами, расположенными на хромосоме клетки – донора.
- абортивная трансдукция: перенесенный фагом фрагмент хромосомы клетки – донора не включается в хромосому клетки – реципиента, а располагается в ее цитоплазме автономно. При делении клетки этот фрагмент может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.о. утрачивается в потомстве.
Задания
1. В стерильные чашки Петри разлить среду Эндо. Чашки со средой подсушить.
2. В стерильную пробирку поместить по 1 мл фаголизата E. coli lac+ и суточной культуры E. coli lac- (рис. 41).
3. Пробирку поместить в термостат не менее чем на 60 мин. при температуре 37 ºС.
4. Чашку Петри разделить пополам и в одну половину внести и растереть стеклянным шпателем 30 мкл культуры E. coli lac-, а в другую – 30 мкл содержимого пробирки после инкубации.
5. Чашки поставить в термостат для культивирования при температуре 37 ºС на 1-2 суток.
6. Сделать выводы по работе.
Рисунок 40. Этапы трансдукции
Рисунок 41. Схема опыта
Контрольные вопросы
1. Каким образом фаговая инфекция может служить механизмом обмена генетическим материалом между бактериями?
2. Какой процесс называют трансдукцией?
3. Какие типы трансдукции выделяют?
РАЗДЕЛ 8: БАКТЕРИОФАГИ
Лабораторная работа № 20
Бактериофаги
Цель работы: изучить действие бактериофага на чистую культуру микроорганизмов.
Материалы и оборудование: чистая культура микроорганизма, культура бактериофага, автоматические пипетки со стерильными наконечниками, спиртовки, чашки Петри со средой LB, термостат.
Основные положения
Бактериофаги (фаги) (с греч. "пожираю") - вирусы, избирательно пожирающие бактериальную клетку. Размер фагов достигает от 20 до 200 нм.
Бактериофаг был открыт канадским ученым Феликсом Эрлемом в 1917 году.
Бактериофаги - удобная модель для расшифровки генетического кода, изучения тонкой структуры гена, молекулярных механизмов мутагенеза, влияния ионизирующего излучения и других факторов на наследственные структуры организма. Система «фаг - бактериальная клетка» является идеальным объектом для изучения взаимоотношений вируса и клетки, в частности онкогенеза. Бактериофаги используют в генетической инженерии, для диагностики и лечения различных инфекционных болезней.
В зависимости от наличия и характера основных структурных компонентов (рис. 42) – головки и отростка – бактериофаги подразделяются на морфологические типы, в пределах которых, в свою очередь, возможны различные варианты, что делает мир бактериофагов очень разнообразным (рис. 43).
Рисунок 42. Схематическое строение бактериофага
Действие фага осуществляется следующим образом: фаг приближается к бактерии и хвостовые нити его связываются с рецепторными участками на поверхности бактериальной клетки. Хвостовые нити изгибаются, а шипы и базальная пластинка прикрепляются к поверхности клетки. Хвостовая оболочка сокращается, и полый стержень проникает в клетку. В базальной пластинке находится фермент лизоцим, растворяющий клеточную оболочку бактериальной клетки. В результате ДНК или РНК вводится внутрь бактериальной клетки. Фаг инактивирует ДНК и РНК хозяина (происходит трансдукция) и подчиняет себе клеточный аппарат синтеза белка.
Нуклеиновая кислота фага реплицируется и образуются новые частицы фага. Под действием лизоцима клеточная оболочка лопается и новообразовавшиеся фаги высвобождаются, инфицируя другие бактерии. Весь цикл размножения бактериофага занимает 30 -40 мин, в результате может образоваться до 200 фаговых частиц.
Выявить бактериофаги можно при нанесении содержащего их материала на плотные питательные среды, засеянные чувствительной бактериальной культурой на которой появляются зоны лизиса бактерий - стерильные пятна, негативные колонии (рис. 44).
Важным свойством фагов, на котором основана фагодиагностика, является их специфичность, они лизируют культуры определенного вида, более того, существуют так называемые типовые бактериофаги, лизирующие варианты вида бактерий.
Рисунок43. Морфология бактериофагов. I –нитевидные фаги, II – фаги без отростка,
III – фаги с аналогом отростка, IV – фаги с коротким отростком, V – фаги с несокращающимся отростком, VI - фаги с сокращающимся отростком.
Рисунок 44. Стерильные пятна, образованные типовыми бактериофагами
Задания
1. В стерильные чашки Петри разлить питательную среду LB;
2. Взять 50 мкл чистой культуры микроорганизма и засеять сплошной газон в чашке;
3. На обратной стороне чашки Петри нарисовать в верхней части небольшой круг и опустить вниз прямую линию;
4. В отмеченный круг с внутренней стороны чашки на агаризованную среду капнуть 20 мкл бактериофага и дать капле стечь вниз по направлению линии;
5. Чашки поставить в термостат при температуре 28 °С на 2 суток;
6. Зафиксировать полученный результат, сделать вывод.
Контрольные вопросы
1. К какому классу организмов относятся бактериофаги?
2. В каких исследованиях применяют бактериофаги?
3. Какие морфологические типы бактериофага выделяют?
4. Как осуществляется действие фага на клетку?
5. Как выявить бактериофага?
6. На каком свойстве фага основана фагодиагностика?
Лабораторная работа № 21
