у бактерий: конъюгация
Цель работы: изучить способы переноса генетического материала в бактериальную клетку методом конъюгации.
Материалы и оборудование: чистые культуры донора (F+) и реципиента(F‑) в пробирках, стерильные пробирки, автоматические пипетки со стерильными наконечниками, спиртовки, чашки Петри с селективной питательной средой, термостат.
Основные положения
Конъюгация – однонаправленный перенос части генетического материала (плазмиды, бактериальной хромосомы) при контакте двух бактериальных клеток.
Этот процесс имеет большое значение в природе, т.к. способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Возможность клетки стать донором определяется специфическим половым фактором – F-фактором.
F+ – клетка-донор;
F- – клетка- реципиент.
Наличие в F+- клетки F-плазмиды обуславливает образование на поверхности клетки одной – двух половых фимбрий (F-пили), которые способствуют соединению клетки-донора с клеткой-реципиентом.
Рисунок 38. Схема процесса конъюгации у бактерий
Механизм конъюгации:
1. Прикрепление клетки – донора к реципиенту с помощью F-пили;
2. Формирование между клетками конъюгационного мостика;
3. Передача F–фактора и других плазмид в реципиентную клетку (рис. 38). Плазмидой кодируется эндонуклеаза, разрезающая одну из нитей её ДНК в определённой точке. Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом переносится в клетку-реципиент. Перенос идёт через поры в клеточной стенке. В первом сегменте поступающей в клетку реципиента нити ДНК расположены антирестрикционные гены, обеспечивающие накопление белков, блокирующих процесс разрушения ДНК рестриктазами. Наконец, переданная цепь замыкается в кольцо и на её основе восстанавливается двунитевая структура ДНК плазмиды. Весь процесс длится несколько минут. При попадании F-фактора в клетку – реципиент, она становиться F+ и приобретает способность передавать F-фактор другим клеткам. В результате переноса F-фактора из клетки-донора в клетку-реципиента получается рекомбинант или трансконъюгант.
F-плазмида может включаться в определенные места бактериальной хромосомы и становиться ее частью, образуя Hfr-штамм (High frequency of recombination – высокая частота рекомбинации). При конъюгации Hfr-штамма с клеткой-реципиентом F-фактор не передается, а передается определенная часть генов хромосомы бактерии.
Задания.
1. Внести в стерильную пробирку по 1 мл культуры донора и реципиента.
2. Пробирку закрыть пробкой и поставить в термостат не менее чем на 30 мин. при температуре 37 ºС.
3. Чашку Петри со специфической питательной средой (отсутствуют в составе аминокислоты триптофан (Trp-), лейцин (Leu-) и тирозин (Tyr-)) разделить на 3 сектора, обозначив каждый согласно схеме (рис. 39).
4. В каждый сектор чашки провести посев 30 мкл культуры из соответствующей пробирки, растереть стеклянным шпателем.
5. Чашки поставить в термостат для культивирования при температуре 37 ºС на 1-2 суток.
6. Сделать выводы по работе.
Рисунок 39. Схема опыта
Контрольные вопросы
1. Какой процесс называют конъюгацией?
2. Какой процесс называют конъюгацией?
3. Чем определяется возможность клетки стать донором?
4. Как клетку-донора можно отличить от клетки-реципиента?
5. В чем заключается механизм конъюгации? Перечислите все этапы.
6. Как называют штамм микроорганизма, который получается в результате конъюгации?
7. Как получаются Hfr-штамм?
8. Что получает рекомбинант при конъюгации Hfr-штамма с клеткой-реципиентом F-фактор?
Лабораторная работа № 19
