Биохимические свойства микроорганизмов

 

Цель работы: изучить биохимические свойства различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: чистые культуры исследуемых микроорганизмов, микробиологические петли, автоматические пипетки со стерильными наконечниками, спиртовки, набор дифференциально-диагностических питательных сред.

Основные положения

Биохимическая активность микроорганизмов чрезвычайно разнообразна. Она обусловлена богатством у них специфических ферментативных систем и условиями среды. В медицинской микробиологии изучение биохимических свойств микробов является одним из основных дифференциально-диагностических методов для точного распознавания возбудителя болезни.

Для биохимической дифференциации микробов, как правило, изучаются их способность:

1) сбраживать углеводы с образованием кислоты или кислоты с газом;

2) разлагать белковые продукты;

3) редуцировать краски.

Для обнаружения этих свойств пользуются посевом микроорганизмов на дифференциально-диагностические питательные среды. Результат реакции определяется при помощи добавляемых в питательную среду различных индикаторов, дающих в большинстве случаев цветные реакции. Метод посева микробов на дифференциально-диагностические среды называется «пестрый ряд».

Задания

А). Сбраживание углеводов:

1) створаживание молока: молоко засеять кишечной палочкой, поставить в термостат при температуре 37 ºС, через сутки провести наблюдение, сделать выводы;

2) использование среды Эндо: среду Эндо разлить в чашки Петри, методом штриха провести посев кишечной палочки, поставить в термостат для инкубирования, через 2-3 суток провести наблюдение, сделать выводы;

3) использование углеводов и спиртов: в стерильные пробирки разлить по 10 мл среды, содержащей в качестве основного фона пептон (5 г/л) и К₂НРО₄(1 г/л), углеводы (в конечная концентрация 1%) и индикатор – бромкрезолпурпур (конечная концентрация 0,003%), изменяющий цвет от пурпурного к желтому в интервале рН 6,8 – 5,2. На дно каждой пробирки опустить поплавок. Среды засеять суспензией клеток микроорганизмов и инкубировать до 5 суток при соответствующей температуре. Заполнить таблицу 10и сделать вывод по работе.

Таблица 10. Результаты наблюдений

Название микроорганизма     Биохимические  свойства	Escherichia coli	Pseudomonas putida	……	……
Рост на углеводах:
Ксилоза
Глюкоза
Маннит
……
Образование газа в поплавке
Ксилоза
Глюкоза
Маннит
……
Изменение цвета индикатора (бромкрезолпурпур) при росте на углеводах:
Ксилоза
Глюкоза
Маннит
……

 

Б). Расщепление белков, являющееся одной из стадий круговорота азота в природе, сопровождается образованием аммиака, индола и выделением сероводорода. Для обнаружения этих веществ в стерильные пробирки разлить по 10 мл соответствующих сред, провести посев исследуемых микроорганизмов. Пробирки закрыть ватными пробками. Пробки завернуть в полиэтилен, чтобы затруднить улетучивание газа. Пробирки поставить на культивирование при соответствующей температуре. Результаты эксперимента занести в таблицу.

1) обнаружение аммиака: В качестве среды используют 4% пептонную воду (пептон – 40 г/л, Na₂HPO₄ – 2 г/л, NaCl – 5 г/л) после того как культура вырастет, делают качественную реакцию на аммиак с реактивом Несслера. На предметное стекло помещают несколько капель культуральной жидкости и добавляют к ним каплю реактива Несслера. В присутствии следов аммиака жидкость окрашивается в желтый цвет, при большом количестве аммиака образуется коричневый осадок.

2) обнаружение сероводорода: в пробирки с МПБ (мясной пептон – 10 г/л, мясной экстракт – 10 г/л, NaCl – 5г/л), содержащем раствор цистеина (0,01% добавить после автоклавирования среды), провести посев исследуемых микроорганизмов. После посева под ватной пробкой укрепить узкую стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченной раствором уксуснокислого свинца. Полоски не должны прикасаться к питательной среде.

3) проба на индол: В качестве среды для выявления образования индола в пробирки с МПБ (пептон – 10 г/л, мясной экстракт – 10 г/л, NaCl – 5г/л), содержащем раствор триптофана (0,01% добавить после автоклавирования среды). После того как культура вырастет, проводят качественную реакцию на индол с реактивом Эрлиха (или Ковача). Для этого на поверхность среды, не перемешивая, помещают 1 мл реактива Эрлиха (или Ковача); появление красной окраски свидетельствует об образовании индола.

- заполнить таблицу 11и сделать вывод по работе

 

 

Таблица 11. Результаты наблюдений

Название микроорганизма   Биохимические свойства	Escherichia coli	Pseudomonas putida	…	…
Цвет пробы с реактивом Несслера
Выделение аммиака
Цвет бумаги, смоченной (СН3СОО)2Рb
Выделение сероводорода
Цвет пробы с реактивом Эрлиха (или Ковача)
Выделение индола

 

В) Определение внеклеточных ферментов. Высокомолекулярные соединения (полисахариды, белки, липиды и др.) не могут проникать через мембрану клетки и подвергаются расщеплению экзоферментами бактерий, относящихся к классу гидролаз. Ферменты катализируют гидролиз полимера до растворимых продуктов, обычно димеров или мономеров, которые поступают в клетку с помощью специфических транспортных механизмов. Образование экзоферментов широко распространено среди различных групп микроорганизмов.

1) Амилолитическая активность. Крахмал подвергается гидролитическому расщеплению под действием амилаз, активными продуцентами которых являются различные виды бацилл, псевдомонад, мицелиальных грибов (рис.35).

В чашки Петри с питательной средой (пептон – 10,0 г/л; КН₂РО₄ – 5,0 г/л; растворимый крахмал – 2,0 г/л; агар – 15,0 г/л; рН = 6,8 – 7,0) провести посев исследуемых микроорганизмов штрихом. После культивирования на поверхность среды налить 3-5 мл раствора Люголя. Зону гидролиза крахмала измерить от края штриха (колонии) до границы светлой зоны. Результаты записать в таблицу 12, сделать выводы.

 

Рисунок 35. Определение амилолитической активности: а – схема посева, б – среда с культурами после обработки раствором Люголя

 

Таблица 12. Результаты наблюдений

Название микроорганизма	Размер зоны гидролиза, мм
E. coli
Ps. putida
…..
……

2) Протеолитическая активность. Протеазы катализируют расщепление белков на поли- и олигопептиды. Они выделяются различными видами бацилл, актиномицетов, стафилококка, мицелиальных грибов.

Исследуемые микроорганизмы посеять в пробирки с мясопептонной желатиной (на 100 мл МПБ – 10-15 г желатины). Посев провести уколом. Культивирование провести при комнатной температуре 7-10 суток. Разжижение желатины отметить визуально, указать интенсивность и форму разжижения (рис. 36). Заполнить таблицу 13, сделать выводы.

 

Таблица 13. Результаты наблюдений

Название микроорганизма	Интенсивность разжижения желатины	Форма разжижения желатины
E. coli
Ps. putida
…..

 

Рисунок 36. Схема разжижения желатины микроорганизмами при посеве уколом:

а – кратеровидное, б – реповидное, в – воронковидное, г – мешковидное, д – послойное, е - пузыревидное

 

Г) Редукция красящих веществ.

Редуцирующая способность микроорганизмов определяется их отношением к определенным органическим краскам, которые они переводят в бесцветные лейкопродукты (метиленовая синяя, лакмус, нейтральная красная и др.).

Растворы красок добавить к питательной среде МПА (0,001%) и провести посев уколом исследуемых микроорганизмов. Наблюдать за постепенным обесцвечиванием краски по ходу укола. Сделать вывод по работе.

Контрольные вопросы

1. Какие способности микроорганизмов изучают для биохимической дифференциации микробов?

2. Как проводят изучения биохимических свойств микроорганизмов?

3. Как узнать способность микроорганизма использовать углеводы и спирты в качестве источников углерода и энергии?

4. Какие биохимические свойства можно выявить при расщеплении белков микроорганизмами?

5. Как установить выделение аммиака, сероводорода и индола при росте микроорганизмов на субстратах?

6. К какому классу относятся экзоферменты? Зачем бактериям экзоферменты?

7. Каким способом можно установить амилолитическую активность микроорганизмов?

8. В чем заключается дифференциально-диагностический тест на разжижение желатины? Как с помощью этого теста можно различить микроорганизмы?

9. В результате каких процессов происходит редукция красящих веществ?

 

 

Лабораторная работа № 17