Критическим моментом при размножении растений в культуре in vitro является их перенос в нестерильные условия. Этот вопрос изучается многими исследователями достаточно долгое время, однако, на данный момент не выработано однозначной технологии адаптации растений.
Перенос растений в нестерильные условия создает стрессовую ситуацию, которая и приводит во многих случаях к их гибели. Объясняется это влиянием большого количества внешних и внутренних факторов на процесс адаптации.
Адаптация к меняющимся или новым условиям среды достигается путем перестройки всего комплекса процессов у растений в онтогенезе в границах генетической нормы реакции. Среда обитания растений оказывает как стимулирующее, так и ингибирующее действие на происходящие в организме процессы. Одни и те же факторы среды могут быть стимуляторами для одних процессов в жизненном цикле организма и ингибиторами для других. Значительную роль в адаптации растений к стрессам играют белки.
Достаточно часто исследователями отмечается снижение адаптации при длительном культивировании растений на питательных средах с высоким содержанием ауксинов.
Влажность воздуха при пересадке в нестерильные условия играет определяющую роль, поскольку, произрастая при высокой влажности в культуральных сосудах, растения теряют способность эффективно регулировать водный режим. Из-за неприспособленности к пониженной влажности воздуха листового аппарата (отсутствие или наличие слабого кутикулярного слоя, широко раскрытые устьица) создается дефицит воды вследствие высокой транспирации листьями и низкой поглотительной способности корней. Существует мнение, что первые две недели необходимо поддерживать 100% влажность воздуха и таким образом если не нивелировать полностью, то значительно снизить стресс, вызванный резким изменением этого фактора. Способы решения этой проблемы могут быть различными. Чтобы увеличить влажность, большинство исследователей предлагают изолировать растения внутри ограниченного пространства, например, укрывая их полиэтиленовой пленкой. Однако при локальном поражении микрофлоры появляется опасность заражения всего посадочного материала, находящегося под пленкой. Избежать этого можно, используя индивидуальные сосуды или контейнеры. Можно применять также установку искусственного тумана, однако при этом нужно тщательно отработать режимы полива.
Одним из важнейших факторов, приводящих к гибели культуральных растений, перенесенных в нестерильные условия, является поражение их бактериальной и грибной инфекцией. Растения, выращиваемые в условиях культуральных сосудов, имеют менее развитую покровную систему – у них более тонкая кутикула, тонкие клеточные стенки, во многих случаях отсутствует опушение. У таких растений часто наблюдаются полностью открытые устьица. Все эти факторы позволяют микроорганизмама беспрепятственно проникать внутрь организма и вызывать заболевания, приводящие к гибели растений.
Для уменьшения инфекционного фона во время адаптации часто используют обеззараженный различными способами субстрат.
Способов обеззараживания субстрата довольно много – это автоклавирование, обработка фунгицидами, прогревание и т.д. У всех способов обеззараживания присутствуют недостатки.
Некоторые авторы считают, что адаптацию растений можно проводить в нестерильный субстрат.
При пересадке на нестерильный субстрат стараются создать условия, максимально приближенные к культуральным с тем, чтобы впоследствии постепенно изменяя их, адаптировать растение.
У культуральных растений, выращенных практически при 100% влажности воздуха в сосудах, листья имеют постоянно открытые устьица. В связи с этим имеется водный дефицит, создаваемый высокой транспирацией листьев и низкой поглотительной способностью корней. Поэтому для успешной адаптации некоторыми исследователями предлагается создать условия, максимально приближенные к условиям культивирования на питательной среде: температуру 20-24, влажность воздуха 90-100%, 16-часовой светопериод.
В условиях теплицы влажность играет важную роль, поскольку произрастая при высокой влажности в культуральных сосудах растения теряют способность эффективно регулировать водный режим. Из-за неприспособленности листового аппарата к пониженной влажности воздуха создается дефицит воды вследствие высокой транспирации листьями и низкой поглотительной способности корней. Отсутствие транспирации, так как градиент водного потенциала отсутствует и движущей силы нет, то устьица все время остаются открытыми и теряют способность закрываться.
В некоторых случаях выдерживание пробирочных растений при пониженных температурах перед высадкой их в нестерильные условия способствовало их дальнейшей адаптации. По данным некоторых исследователей, к уменьшению транспирации вследствие прикрывания устьиц приводило погружение корней растений в 0,02% раствор 2,4-Д, раствор абсцизовой кислоты (Silva et al., 1985) и кальция.
Дополнительное обогащение культуральных растений СО2 на этапе адаптации положительно влияло на приживаемость и рост регенерантов.
В связи с низкой приживаемостью культуральных растений высокие требования предъявляются к почвенному субстрату. По мнению одних исследователей, лучше всего использовать торф, песок и перлит в соотношении 1:1:1.
Один из путей решения проблемы адаптации растений к нестерильным условиям – акклиматизация их непосредственно в культуральных сосудах со снятым покрытием. Однако вертикальное расположение культивационного сосуда, с которого снимают покрытие, приводит к попаданию микроорганизмов на поверхность питательной среды и растений, что ухудшает их приживаемость. Некоторые исследователи предлагают вращать сосуды со снятыми покрытиями в аппарате роллерного типа в вертикальной плоскости. Горизонтальное расположение сосудов в этом случае предотвращает инфицирование питательной среды и растений.
Дополнительные подкормки пересаженных растений раствором питательных сред часто повышают приживаемость растений и оптимизируют из рост и развитие.
