В первых работах по культивированию растительных тканей использовали достаточно простые методики. В частности, инициацию развития каллуса и его последующее культивирование проводили, как правило, на полужидких средах, содержащих агар. Однако при изучении многих вопросов, связанных с питанием, метаболизмом и ростом клеток в условиях in vitro, культивирование проводили на жидких средах. Во многих работах проводили перемешивание питательной среды. При этом облегчается газообмен, снижаются градиенты питательных веществ.
Процесс микроклонального размножения растений состоит из ряда последовательных операций, каждая из которых имеет свою специфику. При отборе и введении эксплантов в культуру важную роль играют такие факторы, как сортовые и видовые особенности, строение и происхождение экспланта, состав питательной среды, физические условия культивирования.
Сортовые и видовые особенности. Способность растения к размножению, как и любой другой признак, обусловлена генетически. На сегодняшний день далеко не для всех культур найден способ успешного размножения in vitro, хотя некоторые из таких культур очень хорошо размножаются вегетативно обычными способами (облепиха).
У разных сортов в пределах одного вида растений способность к размножению варьирует в довольно ограниченных пределах, причем интересно отметить, что наиболее резкие отличия в коэффициенте размножения проявляются на первых стадиях культивирования, в первых пассажах, а в дальнейшем разница сглаживается.
Выбор экспланта и подготовка маточного растения.
В качестве эксплантов используют различные части и органы растений, однако, если в задачи не входит получение каллусной ткани с эмбриогенными свойствами, то оптимальным можно считать использование апикальных меристем побегов.
Говоря о происхождении экспланта, в первую очередь имеют в виду расположение вычленяемой части на растении, а также характер самих растений – источников экспланта (сеянцы в ювенильной фазе, взрослые деревья, растения, подвергшиеся той или иной обработке). Широко используются боковые или верхушечные почки, сегменты стеблей и корней, высечки из листьев, пыльники, элементы цветков и т.д.
Культуры пазушных побегов обычно инициируются из экспланта верхушки побегов или пазушной почки. Культуры придаточных побегов также инициируются из таких эксплантов, а также из фрагментов междоузлий, листьев, семядолей, подсемядольных колен и зародышей.
В целом отмечено, что использование эксплантов большого размера, включающих меристематические зоны, скорее приводит к успеху, чем использование меристематических верхушек. Прежде всего сокращается лаг-период при введении в культуру, что обусловлено влиянием окружающей ткани.
В том случае, если экспланты берут со старых деревьев, для преодоления некротизации и успешного введения в культуру применяют омолаживающую предобработку в растворе 6-БАП. Экспланты, взятые с двулетних укорененных черенков, обладали более высокой жизнеспособностью и в дополнительной обработке не нуждались.
При взятии эксплантов растений, ткани которых содержат высокое количество фенольных соединений (дуб), проводят предварительные обработки антиоксидантами, основными из которых являются аскорбиновая кислота, лимонная кислота, некоторые аминокислоты.
Многочисленными исследованиями доказано, что экспланты растений, находящихся в ювенильной фазе, имеют гораздо больше потенции по массовому формированию побегов и их укоренению по сравнению с эксплантами взрослых деревьев.
Ювенильные формы имеют особое значение для вегетативного размножения древесных растений как традиционными методами, так и в условиях in vitro. Ювенильная фаза – фаза очень активного роста, часто характеризующаяся определенными морфологическими особенностями, такими как особая форма листьев, наличие шипов, неспособность к образованию цветков. В этой фазе вегетативное размножение обычно легко осуществимо. Ювенильное состояние продолжается несколько лет в зависимости от вида растения. В конце концов древесное растение приобретает способность образовывать цветки, плоды и семена и вступает во взрослую стадию, характеризующуюся пониженной способностью к вегетативному размножению, которая с годами становится все более выраженной. Однако переход из ювенильной фазы, по-видимому в какой-то степени обратим, и обычно некоторые ткани взрослого растения обладают определенными физиологическими свойствами, характерными для проростков, например, высокой способностью к образованию придаточных корней. Такие ткани описываются как реювенилизированные.
Использование эксплантов из естественным образом реювенилизированных тканей перспективно для некоторых покрытосеменных лесных пород. Экспланты из волчков Populus sp. сразу же начинают расти и размножаться на питательной среде, тогда как материал из воздушных побегов часто не начинает рост в течение нескольких месяцев.
На стадии введения в культуру важную роль играет стерилизация экспланта, поскольку питательные среды являются отличным субстратом для развития бактериальной и грибной инфекции. Для стерилизации обычно используют ртуть-содержащие препараты (диацид, сулема) или препараты, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия, гипохлорит кальция). Для снижения численности популяции сапрофитных микроорганизмов на поверхности эксплантов практикуют промывку проточной водопроводной водой в течение длительного времени с последующей обработкой одним из стимулирующих веществ.
