Ферменты, их роль в обеспечении жизнедеятельности микроорганизмов.

 

Все разнообразные и многочисленные биохимические реакции, протекающие в живом организме в связи с его обменом веществ, ростом и развитием, совершаются при участии ферментов – биологических катализаторов, вырабатываемых клетками организма.

Ферменты «есть в полном смысле возбудители жизни»,— писал академик И. П. Павлов.

Структура и свойства ферментов. Ферменты представляют собой белки простые (протеины) или сложные (протеиды), состоящие из белка и небелкового компонента, называемого простетической (активной) группой. Таким образом, есть ферменты однокомпонентные и двухкомпонентные.

В состав простетической группы ферментов входят витамины или их производные, различные металлы (Fе, Со, Сu), азотистые основания и др.

Простетическая группа ферментов обусловливает их каталитическую способность, а белковая часть – специфические свойства, избирательную способность действовать на определенный субстрат.

Прочность связи простетической группы с белком у разных ферментов неодинакова. У некоторых простетическая группа легко может отделяться от белковой части и вступать во временную связь с другими белками. Такие простетические группы называют коферментами.

В однокомпонентных ферментах роль активной группы выполняют определенные химические группировки в молекуле белка, составляя активный центр фермента. Такими группировками могут быть SН-группа, остатки отдельных аминокислот и др.

Ферменты обладают очень высокой активностью. Ничтожно малого количества фермента достаточно, чтобы вовлечь в реакцию значительную массу реагирующего вещества (субстрата). Например, грамм амилазы при благоприятных условиях может превратить в сахар тонну крахмала.

Ферменты действуют чрезвычайно быстро, резко ускоряя реакцию. Молекула фермента за минуту может вызвать превращение десятков и сотен тысяч молекул соответствующего субстрата.

Характерной особенностью ферментов, отличающей их от неорганических катализаторов, является субстратная специфичность и специфичность действия – каждый фермент взаимодействует лишь с одним определенным веществом и катализирует лишь одно из тех превращений, которым может подвергаться данное вещество. Например, фермент лактаза вызывает расщепление только молочного сахара (лактозы) на глюкозу и галактозу и не действует на другие углеводы; фермент. Каталаза – только перекись водорода с образованием воды и свободного кислорода и т. д.

Специфичность ферментов обусловлена структурными особенностями молекул фермента и субстрата. Субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку.

Катализируемая ферментом реакция начинается со связываания субстрата с белковой частью фермента в определенном участке ее – активном центре. Образуется комплекс фермент-субстрат. По окончании реакции образовавшийся комплекс фермента с продуктами реакций распадается с освобождением исходного фермента и конечных продуктов ферментативного процесса (рис.).

 

 

 

Рис. Схема взаимодействия фермента с субстратом

 

Ферменты отличаются неустойчивостью (лабильностью) к воздействию ряда факторов внешней среды. Эта неустойчивость во многом объясняется белковой природой ферментов и выражается в том, что они теряют свою активность (инактивируются).

Условия действия ферментов. Важнейшим фактором, определяющим активность ферментов, является температура. По мере повышения температуры возрастает начальная скорость ферментативной реакции. Однако при достижении известного предела дальнейшее повышение температуры вызывает денатурацию ферментного белка. Концентрация активного фер­мента в субстрате непрерывно уменьшается, и чем выше тем­пература, тем быстрее происходит деструкция фермента. Эта сложная зависимость ферментных реакций от температуры по­казана на рис. 19.

Ход ферментативной реакции при различных значениях тем­пературы практически характеризуется кривой ОМС, как неко­торой результирующей двоякое действие повышения темпера­туры: с одной стороны, ускорение химической реакции, с дру­гой— повышение скорости инактивации фермента.

Оптимальная температура, при которой данный фермент наиболее активен, для разных ферментов различна и в извест­ной мере характеризует каждый фермент. У холодолюбивых микроорганизмов температурный оптимум ферментов значи­тельно ниже, чем у теплолюбивых. Однако оптимальная темпе­ратура действия каждого фермента не является постоянной величиной и зависит от условий, в частности от продолжитель­ности реакции.

Некоторые ферменты после тепловой инактивации восста­навливают свою каталитическую активность (в случае обрати­мого процесса денатурации белка).

Уровень температуры, вызывающий денатурацию различ­ных ферментов, неодинаков. Для одних ферментов это 40— 50 °С, для других (термоустойчивых) — только 70 °С, но при температуре около 100 °С почти все ферменты полностью инак-тивируются.

При температуре ниже оптимальных пределов скорость ферментативных процессов уменьшается. В условиях темпера­тур, близких к нулю, и особенно ниже нуля, эти реакции значительно за­медляются, а некоторые приостанав­ливаются, хотя при таких температу­рах ферменты заметно не разруша­ются. Имеются исследования, показы­вающие, что ферменты сохраняют свою активность в замороженных про­дуктах.

Лучистая энергия (ультрафи­олетовые лучи, радиоактивные излу­чения) инактивирует ферменты.

Большое влияние на ход фермен­тативных процессов оказывает рН среды. Для одних ферментов лучшей является среда со слабокислой реак­цией, для других — со слабощелочной реакцией. Для действия каждого фер­мента имеется свое оптимальное зна­чение рН среды. При значении рН выше или ниже оптимальной величины активность ферментов снижается.

На активность ферментов влияет и присутствие в среде некоторых химических веществ. Одни из них ускоряют фермен­тативную реакцию (активаторы), другие способны снижать ее или полностью приостановить (ингибиторы). Действие многих активаторов и ингибиторов специфично.

Активаторами ферментов являются металлы (Си, N1, Л^, Со) и некоторые органические вещества, например ви­тамины.

Ингибиторами ферментов служат соли тяжелых металлов, антибиотики, и др. Сущность действия ингиби­торов состоит в том, что они соединяются с активными груп­пами или активными центрами ферментов, парализуя тем са­мым связывание с ними субстрата.

Концентрация субстрата, т. е. вещества, на которое действует фермент, и концентрация фермента также влияют в известной мере на скорость процессов. При малых концентрациях субстрата, когда фермент оказывается в из­бытке, скорость ферментативной реакции падает; уменьшение скорости реакции наблюдается и при избытке субстрата.

Биохимические процессы, протекающие в микробных клет­ках, регулируются ферментами, поэтому любой фактор, дейст­вующий на активность фермента, будет, действовать и на мик­роорганизм.

Каждый микроорганизм обладает комплексом разнообраз­ных ферментов, своеобразием и активностью которых определя­ется их биохимическая деятельность, избирательность в отноше­нии питательных веществ, роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе, в процессах порчи пищевых продуктов.

Многие ферменты микроорганизмов аналогичны ферментам растений и животных, но существуют и такие, которые не встре­чаются ни в растениях, ни у животных.

Ферменты, присущие данному микроорганизму, входящие в число компонентов его клетки, называют конститутив­ными. Существуют ферменты индуцируемые (адаптив­ные), которые вырабатываются клеткой только при добавлении к среде вещества (индуктора), стимулирующего синтез данного фермента. Например, микроорганизм, не ассимилирующий маль­тозу, можно приучить к использованию ее, культивируя в среде с этим сахаром как единственным источником углерода. В этих условиях микроорганизм синтезирует фермент мальтазу, кото­рым' ранее он не обладал.

В живой клетке действие ферментов происходит упорядо­чение, строго согласованно. Ферменты локализованы в различ­ных клеточных структурах (в мезосомах, митохондриях, цито-плазматической мембране и др.).

Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами наружу (в среду); их принято называть экзоферментами. Они иг­рают большую роль в подготовке пищи к ее поступлению в клетку. Происходит внеклеточное «переваривание» пищи — расщепление сложных веществ субстрата (крахмала, белков и др.) на более простые, способные проникать в клетку. Фер­менты, не выделяющиеся при жизни клетки в окружающую среду, называют эндоферментами (внутриклеточными). Они участвуют во внутриклеточных процессах обмена веществ.

Хотя ферменты вырабатываются клеткой, но и после ее смерти временно_остаются в активном состоянии и может про­изойти автолиз (от греч. autos — сам, lysis — растворение) — саморастворение, или самопереваривание, клетки под влиянием внутриклеточных ферментов. При разрушении клеток ферменты поступают в среду — в субстрат, в котором развивались микро­организмы. При хранении пищевых продуктов, значительно об­семененных микроорганизмами, даже в условиях, исключающих их развитие, возможно снижение качества продуктов за счет 'ферментов автолизированных микробных клеток.

Классификация ферментов

Номенклатура ферментов складывалась постепенно, по мере их открытия и изучения. Названия ферментов вначале носили случайный характер. Например, фермент, расщепляющий крах­мал, был назван диастазом, а фермент желудочного сока, рас­щепляющий белки, — пепсином. Позднее название фермента стали составлять из корня слова, обозначающего вещество, на которое действует фермент, добавляя к нему окончание «аза». Фермент, расщепляющий крахмал (амилум), стали называть амилазой, фермент, разлагающий мальтозу, — мальтазой и т. п. Наряду с этим ферменты называют и по функции — по химиче­ским процессам, которые они катализируют. Например, фер­менты, катализирующие отщепление водорода от субстрата (дегидрогенерирование), называют дегидрогеназами, а расщеп­ляющие сложные органические соединения путем гидролиза — гидролазами и т. д.

В соответствии с принятой в настоящее время классифика­цией ферментов (Правила номенклатуры ферментов, 1972) все ферменты делят на 6 классов: 1 —оксидоредуктазы; 2 — транс-феразы; 3 — гидролазы; 4 — лиазы; 5 — изомеразы; 6 — лигазы. Классы подразделяют на подклассы, которые делят на под-подклассы. Каждый фермент имеет название и шифр из четырех цифр. Первая цифра обозначает класс, вторая — подкласс, тре­тья — подподкласс, четвертая — порядковый номер данного фер­мента.

В настоящее время известно более 1000 ферментов.

Ниже рассматриваются только некоторые наиболее распро­страненные ферменты микроорганизмов. I Оксидоредуктазы — окислительно-восстановительные фер­менты. В этот класс входят многочисленные ферменты, катали­зирующие окислительно-восстановительные реакции процессов дыхания и брожения микроорганизмов. Среди оксидоредуктаз. различают следующие ферменты.

Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие реакцию де-гидрогенерирования органических соединений: отщепление водо­рода. Отнятый водород' передается дегидрогеназой какому-либо другому веществу (промежуточному — временному или конеч­ному акцептору водорода). Одновременно одно вещество окис­ляется, а другое восстанавливается.

Дегидрогеназы специфичны по отношению к донору водо­рода (веществу, подвергающемуся дегидрогенерированию) и к акцептору водорода. Их делят на анаэробные и аэробные.

Анаэробные (первичные) дегидрогеназы пере­дают отнятый от окисляемого субстрата водород другим дегид-рогеназам или молекулам каких-либо органических веществ. Эти дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами. Их простетическая группа при диализе легко отделяется в виде ко-фермента.

Коферменты анаэробных дегидрогеназ построены по типу ди-нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит органическое основа­ние (чаще гетероциклическое), которое через пентозу соединено с фосфорной кислотой. Коферментом многих анаэробных дегид­рогеназ является никотинамид-аденин-дийуклеотид (сокра­щенно НАД). Кофермент, присоединяя водород от окисляемого вещества, превращается в восстановленную форму — НАД • Нг. Передавая затем водород другому веществу, он восстанавливает его, а НАД • Нг снова превращается в НАД (окисляется).

Анаэробные дегидрогеназы имеются как у анаэробов, так и у аэробов (см. с. 65).

Аэробные (вторичные) дегидрогеназы передают активированный водород, отнятый у окисляемого вещества или от восстановленной анаэробной дегидрогеназы, кислороду воз­духа непосредственно либо через промежуточных переносчиков.

Аэробные дегидрогеназы, передающие водород субстрата только непосредственно кислороду, называют оксидазами. К оксидазам относится, например, полифенолоксидаза, катали­зирующая реакцию окисления полифенолов с образованием тем-ноокрашенных соединений меланинов. Этот фермент имеется у многих плесневых грибов. Действие полифенолоксидазы про­является в потемнении тканей плодов и овощей, пораженных этими плесенями.

К аэробным дегидрогеназам относятся флавиновые фер­менты, коферментом которых является флавин-аденин-дину-клеотид (ФАД). Поскольку в состав кофермента входит рибо-

Примерами карбогидраз, расщепляющих дисахариды, распро­страненных у микроорганизмов, являются следующие ферменты.

Мальтаза (а-глюкозидаза) расщепляет мальтозу (солодо­вый сахар) на две молекулы глюкозы.

Сахараза (инвертаза, р-фруктофуранозидаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу.

Л акта за (р-галактозидаза) расщепляет молочный сахар (лактозу) на галактозу и глюкозу.

Из гидролаз, действующих на полисахариды, наибольшее значение имеют следующие.

Амилазы — ферменты, катализирующие гидролиз крах­мала. Известно три типа амилаз: а-амилаза, р-амилаза и глю-коамилаза. Они отличаются между собой по свойствам и спо­собу действия на крахмал. Амилазы находятся в плесневых грибах и многих бактериях. Дрожжи не содержат амилаз.

а-Амилаза расщепляет крахмал преимущественно на сравни­тельно низкомолекулярные декстрины. Мальтозы получается мало.

Р-Амилаза расщепляет крахмал с образованием главным об­разом мальтозы и небольшого количества декстринов (высоко­молекулярных).

Глюкоамилаза расщепляет крахмал, образуя преимущест­венно глюкозу и небольшое количество декстринов.

Целлюлаза — фермент, гидролизующий целлюлозу (клет­чатку) с образованием дисахарида целлобиозы, который в даль­нейшем при участии фермента целлобиазы (р-глюкозидазы) рас­щепляется на две молекулы глюкозы. Целлюлаза встречается в грибах и некоторых бактериях.

Пектолитические ферменты — это комплекс ферментов, гидролизующих пектиновые вещества. Пектиновые веще­ства в виде нерастворимого протопектина находятся в расте­ниях в качестве межклеточного вещества и входят в состав кле­точных оболочек. При участии пектолитических ферментов (про-топектиназы, пектинэстеразы, полигалактуроназы) протопектин и растворимый пектин гидролизуются с образованием метило­вого спирта, галактуроновых кислот, пентоз, гексоз.

Пектолитические ферменты имеются у многих плесеней и у некоторых бактерий. Развитие этих микроорганизмов в расти­тельном пищевом сырье (плодах, овощах) приводит к мацера­ции (размягчению) их тканей.

Пептидазы (протеолитические ферменты) катализи­руют гидролиз белков, пептидов, расщепляя пептидные связи. Пептидазы обладают специфичностью, которая обусловлена структурой молекулы белка, наличием и расположением опре­деленных химических групп. Каждая пептидаза разрывает пеп­тидные связи между определенными аминокислотами.

Дезаминазы и амидазы — ферменты, катализирующие гид­ролитическое расщепление аминокислот и амидов с отщепле­нием азота в виде аммиака.

Из амидаз существенную роль в азотном обмене микроорга­низмов играют аспарагиназа, катализирующая гидролиз ас-парагина на аспарагиновую кислоту и аммиак, а также глу-таминаза, вызывающая гидролиз глутамина с образованием аммиака и глутаминовой кислоты.

Эстеразы — ферменты, катализирующие реакции расщеп­ления и синтеза сложных эфиров (эстеров). Они широко распро­странены у микроорганизмов. Важную роль в обмене веществ микроорганизмов играют следующие эстеразы.

Липазы — ферменты, вызывающие гидролиз жиров на гли­церин и высокомолекулярные жирные кислоты.

Фосфатазы — многочисленные ферменты, расщепляющие эфироподобные фосфорсодержащие органические соединения с освобождением фосфорной кислоты.

^Лиазы. К классу лиаз относятся ферменты, которые катали­зируют реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от субстрата тех или иных групп: СОг, НгО, Ш₃.

Альдолаза — фермент, обратимо расщепляющий шести-углеродную молекулу фруктозодифосфата на два трехуглерод-ных соединения: фосфодиоксиацетон и фосфоглицериновый альдегид. Этот фермент участвует в начальной стадии превра­щения сахара в процессе дыхания и брожения.

Декарбоксилазы— ферменты, катализирующие декар-боксилирование (отщепление СО2) органических кислот.

Во многих микроорганизмах содержится, например, пиру-ватдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО2 от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альдегида. В состав кофермента этой декарбоксилазы входит витамин Вь

Декарбоксилазы аминокислот участвуют в отщеплении СОг от аминокислот с выделением аминов.

Микроорганизмы, особенно гнилостные бактерии, богаты де-карбоксилазами аминокислот.

уИзомеразы. Ферменты этого класса катализируют превраще­ние органических соединений в их изомеры — внутримолекуляр­ное перемещение радикалов, атомов, атомных группировок.

Примерами могут служить следующие ферменты.

Триозофосфатизомераза катализирует взаимное пре­вращение фосфотриоз: фосфодиоксиацетона и фосфоглицерино-вого альдегида.

Глюкозофосфатизомераза катализирует обратимое превращение глюкозо-6-фосфат во фруктозо-б-фосфат.

Оба этих фермента участвуют на первых стадиях превраще­ния сахара в процессах дыхания и брожения. ^Лигазы (синтетазы). В этот класс входят ферменты, катали­зирующие реакции синтеза сложных органических соединений из более простых. Эти реакции требуют затрат энергии и обычно протекают одновременно с расщеплением пирофосфатной (мак-роэргической) связи в АТФ

 

 

Рибофлавин (витамин В₂), флавиновые ферменты окрашены в жел­тый цвет. Одни флавиновые ферменты могут переносить водород непосредственно на кислород, т. е. являются оксидазами; другие передают водород от окисляющихся веществ кислороду через ряд промежуточных переносчиков. В таких случаях участвуют системы ферментов, а водород многократно переносится от од­ного вещества к другому, пока не достигнет своего конечного ак­цептора — кислорода. Последний подвергается восстановлению с образованием воды или перекиси водорода.

Особо важное значение в процессах аэробного дыхания имеет цитохромная ферментная система, состоящая из цитохро-мов и фермента цитохромоксидазы.

Цитохромы представляют собой гемопротеиды. В состав простетической группы (гема) входит двухвалентное железо. Роль цитохромов в процессе дыхания заключается в последова­тельном переносе электронов от водородного атома восстанов­ленной дегидрогеназы на цитохромоксидазу.

Цитохромоксидаза — двухкомпонентный гемосодержа-щий фермент, катализирует окислительно-восстановительную ре­акцию между восстановленным цитохромом (последним в цепи цитохромов) и кислородом (см. с. 69).

Цитохромная система содержится в клетках всех микроорга­низмов, за исключением облигатно-анаэробных бактерий