Качественный анализ аминокислотных смесей методом тонкослойной хроматографии.
Проводят карандашом линию на расстоянии 2 см от нижнего края хроматографической пластины. На линии на равном расстоянии размечают 4 точки. В пипетку набирают раствор первой аминокислоты. Прикасаясь кончиком пипетки к пластине в точке 1, выпускают раствор. То же проделывают для точек 2, 3, 4 с растворами оставшихся аминокислот и их смесью, каждый раз используя чистую пипетку.
Хроматограмму помещают в хроматографический сосуд, на дно которого налита смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) так, чтобы край пластины был погружен в проявитель на 1 см. Сосуд плотно закрывают крышкой и оставляют в нем хроматограмму на время, за которое проявитель пройдет по ней путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Хроматограмму вынимают из сосуда, отмечают границу фронта проявителя и высушивают на термостолике. На высушенную хроматограмму наносят в спрей-камере при помощи пульверизатора 0,5 %-ный раствор нингидрина в ацетоне до равномерного (без подтеков) смачивания. Затем хроматограмму помещают на термостолик при температуре 70 °С на 15 мин. Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.
Идентификацию аминокислот можно осуществить по значению Rf (коэффициент распределения). Для этого измеряют расстояние, пройденное проявителем от линии старта до границы фронта проявителя, а так же расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты до центра цветного пятна, образовавшегося в результате нингидриновой реакции. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента распределения (Rf) каждой аминокислоты-свидетеля. Такие же расчеты проводят с аминокислотами исследуемой смеси. Сопоставляя величины Rf аминокислот-свидетелей и аминокислот исследуемой смеси, делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, идентичны.
1. Зарисуйте хроматограмму.
2. Рассчитайте значения Rf для всех веществ. Сопоставьте значения.
Вывод:
Анализ компонентов муцина слюны.
Выделение муцина из слюны.
В две пробирки собирают по 1 мл слюны и добавляют в каждую по каплям 1 % раствор уксусной кислоты до появления сгустков муцина. Осадок муцина в пробирках осторожно промывают водой, придерживая сгусток палочкой.
Реакции на белковую часть (биуретовая реакция).
Для открытия белка в пробирку с осадком муцина добавляют при помешивании
10 % раствор гидроксида натрия до растворения сгустка и производят биуретовую реакцию.
Наблюдения:
Вывод:
Реакция на углеводную группировку (нафтоловая проба).
Углеводы муцина обнаруживают нафтоловой пробой (реакция Подобедова - Молиша). Из гексоз под действием серной кислоты образуется оксиметилфурфурол. При взаимодействии его с α-нафтолом образуется окрашенный продукт конденсации.
Во вторую пробирку с осадком муцина добавляют 0,5 мл 1 % спиртового раствора
α-нафтола, перемешивают и по стенке осторожно наслаивают 0,5 мл конц. серной кислоты.
Наблюдения:
Вывод:
Контрольные вопросы
1. Какими свойствами обладают аминокислоты?
2. Дайте определение четырех уровней структуры белка. Какие связи стабилизируют первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуру белка?
3. Что понимают под денатурацией и ренатурацией белков? Какие агенты вызывают денатурацию?
4. Дайте определение ИЭТ и ИИТ для аминокислот и белков.
5. Какое применение находит метод хроматографии в медицине?
6. Как в медицинской практике используются явления денатурации и высаливания белков?
7. Почему для плода, зародыша, новорожденного особую роль играют фосфопротеины?
8. В чем различие между гликопротеинами и протеогликанами? Какие типы связей существуют между углеводными компонентами и белками?
9. Почему гликопротеины менее чувствительны к действию денатурирующих факторов, чем простые белки?
10. Рассмотрите структуру и функции гемоглобина А.
11. Почему гемоглобин зародыша и взрослого обладает разным сродством к кислороду?
12. Что лучше растворяется в воде: нуклеиновые кислоты или нуклеопротеины? Почему?
13. Какие связи удерживают полидезоксирибонуклеотидные цепи в биспиральной молекуле ДНК?
Лабораторная работа «БИОХИМИЯ ФЕРМЕНТОВ»
Цели и задачи: изучить методы определения активности ферментов, влияние активаторов и ингибиторов на их активность, определить экспериментально активность α-амилазы слюны.
Студент должен:
- знать: правила техники безопасности работы в лаборатории биологической химии; строение ферментов, современные представления о механизме действия ферментов, классификацию ферментов, их основные свойства; определение активности ферментов, единицы ее измерения; механизм влияния активаторов и ингибиторов на активность фермента, использование определения активности ферментов в клинической диагностике;
- уметь: обнаруживать ферменты в биологических объектах; проводить эксперимент по изучению влияния активаторов и ингибиторов на активность ферментов; осуществлять определение активности ферментов методом разбавления;
- владеть: техникой лабораторных работ в лаборатории биологической химии; методикой сбора и анализа данных эксперимента.
Ферменты - вещества в основном белковой природы, обладающие каталитической активностью.Ферменты ускоряют протекающие в организме реакции вследствие снижения энергетического барьера реагирующих веществ. Главное отличие ферментов от катализаторов небиологической природы состоит в исключительно высокой каталитической активности и ярко выраженной специфичности действия.
Активный центр фермента - уникальная комбинация аминокислотных остатков, которая обеспечивает непосредственное связывание активного центра с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа.
Существуют простые ферменты: пепсин, трипсин и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков. Небелковые компоненты – кофакторы - могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью.
Классификация ферментов основана на типе катализируемой химической реакции. В соответствии с этим все ферменты делятся на 6 классов:
1. Оксидоредуктазы.
2. Трансферазы.
3. Гидролазы.
4. Лиазы.
5. Изомеразы.
6. Лигазы.
Температура, соответствующая максимальной скорости ферментативной реакции, называется оптимальной (Тopt). Для большинства ферментов организма человека она равна
37-40 °С. При снижении температуры скорость ферментативного катализа падает, достигая при 0 °С минимальной величины. Ферменты термолабильны, т. е. чувствительны к высокой температуре. Большинство ферментов разрушается при нагревании их до 60-70 °С в течение часа, до 80-100 °С - в течение нескольких минут вследствие денатурации.
Для каждого фермента имеется определенное значение рН среды, при котором он является наиболее активным (оптимум рН). При увеличении или понижении кислотности среды активность ферментов снижается. Ферменты, как и другие белки, содержат в своем составе аминокислоты с ионогенными группами в радикалах, степень диссоциации которых зависит от рН. Изменение степени диссоциации этих групп влияет на конформацию фермента и его каталитические свойства.
Специфичность ферментов - способность катализировать строго определенное химическое превращение одного или группы сходных по строению субстратов. Основной причиной специфичности является комплементарность структуры активного центра фермента и субстрата. Абсолютная специфичность – способностьфермента катализировать единственную реакцию. Относительная (групповая) специфичность – способностьфермента катализировать превращение веществ, имеющих общие структурные особенности.
Химические соединения, увеличивающие скорость ферментативной реакции, называются активаторами. Часто активаторами ферментов являются Mg2+, Mn2+, Zn2+, K+ и Со2+.
Ингибиторы тормозят действие ферментов. Любые агенты, вызывающие денатурацию белка, приводят к необратимой инактивации фермента. Специфические ингибиторы действуют на какой-либо один фермент или группу ферментов.
Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным. Конкурентное ингибирование основано на связывании активным центром веществ, имеющих структуру, похожую на структуру субстрата. Степень ингибирования в данном случае зависит от соотношения концентрации субстрата и ингибитора. Метод конкурентного торможения широко применяется в медицинской практике (сульфаниламидные препараты).
При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами. Это приводит к изменению конформации активного центра и снижению активности фермента.
О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. При оптимальных условиях скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента.
Для оценки активности фермента используют стандартные международные единицы (Е или U). За единицу активности 1 U(Е) фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоль субстрата или образование 1 микромоль продукта в минуту (мкмоль/мин).
В Международной системе единиц (СИ) активность фермента выражается в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль/с.
1 U(Е) фермента соответствует 16,67 нкат.
Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка).
Большинство ферментов локализовано в тканях и органах, и их активность в сыворотке крови незначительна. Патологические процессы, связанные с нарушением целостности клеток, способствуют выходу ферментов в кровь. Увеличение активности ферментов сыворотки крови является диагностическим тестом, свидетельствующим о патологии определенных органов и тканей. Количественное определение активности ферментов используется в клинике с целью постановки диагноза, наблюдения за эффективностью лечения и прогноза.
Реактивы и оборудование: слюна; 0,1 и 0,5 % растворы крахмала; 1 %-ный раствор хлорида натрия; 1 % раствор сульфата меди; раствор Люголя; вода дистиллированная; пробирки; водяная баня; пипетки; мерные цилиндры.
