Получение шкалы гидролиза крахмала α– и β– амилазами

Лабораторная работа № 1

Разделение пигментов листа с помощью бумажной хроматографии

 

Вводные пояснения. Пытаясь найти способ разделения пигментов листа на индивидуальные вещества, М.С. Цвет в 1901-1903 гг. открыл принципиально новый метод, который он назвал адсорбционной хроматографией. Через колонку с твердым сорбентом пропускают элюент со смесью растворенных веществ. Так как вещества различаются по степени адсорбции, они перемещаются по колонке с разной скоростью. В результате происходит разделение веществ. Этот прием широко используется в современной биохимии, химии, некоторых отраслях промышленности.

В настоящее время хроматография является важнейшим методом разделения, анализа и физико-химического исследования веществ. Она основана на распределении веществ смеси между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент). Неподвижная фаза обычно представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую (ГХ), газожидкостную (ГЖХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). В качестве неподвижной фазы используют твердые (или твердообразные) тела и сорбированные на твердой фазе жидкости.
По механизму разделения веществ различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, аффинную (биоспецифическую), осадочную хроматографию.

По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы различают колоночную и плоскослойную хроматографию. К плоскослойной относятся тонкослойная хроматография и бумажная хроматография. В колоночной хроматографии выделяют капиллярную хроматографию, в которой сорбент расположен на внутренних стенках колонки, а центральная часть колонки остается незаполненной сорбентом, т.е. открытой для потока элюента. Колонка также может быть набивной – заполненной сорбентом в виде гранул. Известна поликапиллярная хроматография, когда одна колонка содержит до 1000 тончайших капилляров.

Ход работы.

1. Приготовить ацетоновую вытяжку пигментов листа, растирая 3 г листьев с 10 мл ацетона, добавляя его по 1 мл и отфильтровывая экстракт.

2. На листе хроматографической бумаги размером 18×18 снизу провести линию простым карандашом, отступив от края 2 см. Это будет линия старта. Следует учесть, что фронт элюента должен двигаться вдоль волокон бумаги.

3. Бумагу положить на край стола так, чтобы линия старта выходила за край стола. Капилляром нанести вытяжку пигментов на линию старта. Раствор надо наносить в несколько приемов, просушивая предыдущий слой. Зона с вытяжкой пигментов не должна быть толще 0,5…1,0 см.

4. Хроматографическую бумагу с нанесенной вытяжкой свернуть в трубку, концы скрепить скрепкой и помещают в хроматографическую камеру.

5. Заранее следует приготовить хроматографическую камеру. Ее стенки изнутри закрыть фильтровальной бумагой. В камеру поместить элюент состава, мл: бензин – 50, бензол – 35, хлороформ – 10, ацетон – 0,5, изопропиловый спирт – 0,2. Толщина слоя элюента в камере не должна превышать 1 см. Снаружи камеру закрыть черной бумагой. Камеру сверху закрыть стеклом.

6. После разгонки хроматограмму вынуть и просушить. Пигменты располагаются в следующем порядке: хлорофилл b, хлорофилл a, виолаксантин, лютеин, каротины.

7. Рассчитать Rf для каждого вещества.

Контрольные вопросы.

1. Методы выделения органелл.

2. Спектральные методы.

3. Хроматография.

4. Электрофорез.

5. Методы меченых атомов.

6. Генная инженерия и культура клеток как методы биохимии растений.

Материалы и оборудование. Хроматографическая камера; воронка; мерный цилинр на 50 мл; фарфоровая ступка с пестиком; пробирка; штатив для пробирок; мерные пипетки и капилляры; весы; ножницы; скрепки канцелярские; фильтровальная бумага; бензин; бензол; хлороформ; ацетон; изопропиловый спирт; листья растений.

 

 

Тема «Углеводы»

 

Лабораторная работа № 2

Получение шкалы гидролиза крахмала α– и β– амилазами

 

Вводные пояснения. Основным запасным веществом большинства семян является крахмал. Он представляет собой смесь амилозы и амилопектина. Амилоза состоит из неразветвленных цепей, включающих 200-300 остатков глюкозы, связанных в положении α (1→4). Благодаря α-конфигурации при С-1, цепи образуют спираль, в которой на один виток приходится 6-8 остатков глюкозы (1). Синяя окраска растворимого крахмала при добавлении йода связана с присутствием спирали. Амилопектин имеет разветвленную структуру. В среднем один из 20-25 остатков глюкозы содержит боковую цепь, присоединенную в положении α (1→6). Молекула амилопектина может включать сотни тысяч остатков глюкозы и иметь молекулярную массу порядка 108 Да. Амилопектин дает с йодом красно-фиолетовую окраску.

Крахмал расщепляется амилазами. β-Амилаза, гидролизующая наружные нередуцирующие концы цепей полисахарида, полностью гидролизует амилозу до мальтозы, а амилопектин – до мальтозы и декстринов. Последние расщепляются α-амилазой, гидролизующей α-1,4 гликозидные связи, до декстринов с меньшей молекулярной массой. При одновременном действии α- и β-амилаз крахмал гидролизуется на 95%. В сухих семенах имеется β-амилаза, но ее активность невелика. При прорастании в большом количестве синтезируется α-амилаза, и значительно ускоряется гидролиз крахмала.

Активный препарат амилазы получают из солода – проросших и измельченных зерновок ячменя. Такой препарат используют в мальтозной и пивоваренной промышленности. Он содержит α- и β-амилазы. Гидролиз крахмала идет ступенчато, промежуточные продукты – декстрины – окрашиваются йодом в различные цвета в зависимости от степени полимеризации: амилоза – в синий, амилопектин – в красно-фиолетовый, амилодекстрин – в фиолетовый, эритродекстрин – в красный, ахродекстрин – в оранжевый, а мальтодекстрин и мальтоза не дают окрашивания.

Ход работы.

1. Приготовить солодовую вытяжку. Солод массой 10 г растереть в ступке, залить 40 мл воды с температурой 40^оС, добавить немного глицерина, перемешать и настаивать 30 мин, затем профильтровать. Фильтрат разделить на две порции.

2. α-Амилазу выделить из первой пробы, прогревая раствор на водяной бане при температуре 70^оС в течение 15 мин, после чего охладить и использовать в опытах. В этих условиях β-амилаза инактивируется.

3. β-Амилазу выделяют путем инактивирования α-амилазы в кислой среде. Ко второй порции вытяжки добавляют 0,1н. раствор соляной кислоты до достижения рН 3,3, оставляют на 15 мин. Затем добавляют 0,1 н. раствор гидроксида натрия, чтобы довести рН до 6,0.

4. Возможные варианты опыта: вытяжка из сухих семян, вытяжка из набухших семян, препарат α-амилазы из набухших семян, препарат β-амилазы из набухших семян.

5. Приготовить серии из 10 нумерованных пробирок, налить в каждую по 2 мл слабого раствора Люголя и 2 мл крахмального клейстера концентрацией 1%. Предварительно довести рН клейстера до 5,8…6,0.

6. Для составления шкалы гидролиза в первую пробирку налить 0,5 мл воды (контроль), во вторую – 0,5 мл ферментного препарата, в третью и последующие – по 0,5 мл ферментного препарата через каждые 3 мин. Сравнить цвет содержимого пробирок.

7. Результат опыта оформить, закрашивая соответствующие ячейки таблицы 2.1 и подписывая названия углеводов. Сделать выводы.

 

Таблица 2.1 – Цветная шкала степени гидролиза крахмала под действием амилазы в зависимости от времени

№ пробирки
Время инкубации, мин
α-амилаза	Цвет раствора
Вид углевода
β-амилаза	Цвет раствора
Вид углевода