Ферментный метод определения нерастворимых и растворимых пищевых волокон

 

Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам пищеварительного тракта человека из продуктов растительного происхождения. Метод позволяет определить растворимые (в этиловом спирте) и нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим действием.

Реактивы: спирт этиловый и раствор с массовой долей этилового спирта 700 г/дм³; панкреатин; глюкоамилаза очищенная; гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ; протеаза № Р-3910 или другой протеолитический ферментный препарат аналогичной активности (пепсин А из слизистой оболочки желудка свиньи).

Аппаратура, материалы: весы аналитические, баня водяная, шкаф сушильный, стаканы химические, стеклянный пористый фильтр № 100, № 40 или обеззоленный фильтр

4.7.1Подготовка образцов к испытанию. Исследуемый сухой материал измельчают на лабораторной мельнице, просеивают через сито, собирая фракцию с размером частиц не более 1 мм; влажный материал гомогенизируют в гомогенизаторе или в микроизмельчителе тканей.

При содержании жира в образцах более 5% проводят обезжиривание. Для этого навеску образца, предназначенную для определения пищевых волокон, заливают трехкратным объемом петролейного эфира (к массе образца), периодически перемешивают в течение 15 минут и затем отстаивают не менее 1 минуты, прозрачный раствор петролейного эфира декантируют и повторяют экстракцию с темже количеством эфира 2 раза. Обезжиренный образец высушивают на воздухе.

4.7.2. Проведение испытаний. 0,5 г тонкоизмельченного образца, взвешенного с погрешностью не более 0,0001 г, помещают в химический стакан и суспендируют в 30 см³ дистиллированной воды при 40 ^оС в течение 1,5 ч.

Полученную суспензию после настаивания нагревают на кипящей водяной бане для клейстеризации крахмала 30 мин при условии, что температура суспензии достигает 90 ^оС.

После охлаждения смеси до комнатной температуры устанавливают рН 1,5±0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5М, добавляют 100 мг пепсина (активность 1 мкг эквивалентна 5´10^-3 ПЕ_НВ) и ставят на инкубацию при температуре 40 ^оС в течение 1,0-1,5 ч при периодическом помешивании.

Смесь охлаждают до комнатной температуры, устанавливают рН 6,8±0,1 раствором гидроксида натрия концентрацией 3М и приливают 10 см³ 0,05 М раствора пакреатина. Смесь инкубируют в течение 1,0-1,5 ч при помешивании при температуре 40 ^оС.

Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры, приливают 1,0 см³ водного раствора глюкоамилазы концентрацией 50 мг/см³ (рекомендуется использовать 100 единиц активности глюкоамилазы на расщепление 1 г крахмала), устанавливают рН 4,8±0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5М и инкубируют при температуре 40^оС в течение 12 ч.

Полноту гидролиза крахмала проверяют йодной пробой. Для этого несколько капель вышеуказанной смеси помещают на стекло, добавляют каплю йода в водном растворе йодида калия. О присутствии крахмала в препарате пищевых волокон судят по наличию окрашенных в синий цвет крахмальных зерен. В случае положительной реакции на крахмал проводят обработку смеси дополнительным количеством глюкоамилазы (приливают к смеси 5 см³ водного раствора глюкоамилазы концентрацией 5 мг/см³ и инкубиркют 1 ч при рН 4,8±0,1 и температуре 60^оС).

Полученную смесь фильтруют через предварительно доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр №100 или предварительно высушенный и взвешенный обеззоленный фильтр. Нерастворимые пищевые волокна, оставшиеся на фильтре, промывают последовательно 25 см³ 70% раствора этилового спирта (в 2 приема) и 25 см³ ацетона в 2 приема). Фильтрат должен быть прозрачным. Фильтр помещают в сушильный шкаф при температуре 105±1^оС и высушивают до постоянной массы.

Фильтрат делят на две равные части. В одной части фильтрата осаждают растворимые пищевые волокна 4-кратным количеством 96% этилового спирта, взятого к объему фильтрата. Смесь оставляют для осаждения на 10-12 ч, затем фильтруют через доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр № 40 (при необходимости используют слабый вакуум) до получения прозрачного фильтрата. Осадок на фильтре промывают последовательно 25 см³ 70% раствора этилового спирта и 25 см³ ацетона, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 105±1 ^оС до постоянной массы.

В полученных препаратах нерастворимых пищевых волокон определяют содержание непереваренного белка по методу Кьельдаля и золы методом озоления.

Для корректировки данных проводят контрольный опыт без навески образца.

Содержание пищевых волокон в продуктах определяют по следующим формулам.

 

Для нерастворимых пищевых волокон:

 

Х₁ = ; (4.16)

для растворимых пищевых волокон:

 

Х₂ = , (4.17)

 

где Х₁ – содержание нерастворимых пищевых волокон, г на 100 г продукта; Х₂ – содержание растворимых пищевых волокон, г на 100 г продукта; m – навеска образца продукта, г; m₁ и m ₃ – масса остатка нерастворимых или растворимых пищевых волокон после высушивания соответственно, г; m ₂ – масса остатка в контрольном опыте после высушивания, г; В – содержание белка в препарате пищевых волокон, г; С – содержание золы в препарате пищевых волокон, г (возможно использование табличных данных).

Общее содержание пищевых волокон (Х) вычисляют суммированием величин Х₁ и Х₂.

За окончательный результат определения массовой доли нерастворимых или растворимых пищевых волокон принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Определение проводят до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.

Вопросы для контроля

1. Перечислите основные методы определения сахаров.

2. На чем основано определение сахарозы в продуктах?

3. В чем сущность определения редуцирующих сахаров методом Бертрана? При исследовании каких продуктов его используют?

4. Какими методами можно определить лактозу в молоке?

5. На чем основано качественное открытие крахмала в продуктах?

6. В чем сущность цианидного метода определения крахмала?

7. На чем основано определение нерастворимых и растворимых пищевых волокон в продуктах?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ