Вирусы, их природа, происхождение. Методы культивирования вирусов.

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Методы культивирования вирусов

Поскольку вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размно­жаются только внутриклеточно, нужно было найти простые и общедоступные методы их культивирования. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрио­ны, в клетках которых успешно размножаются многие вирусы. Однако оконча­тельное решение проблемы их культивирования оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Хотя способность клеток расти вне организма была установлена еще в 1907 г., потребовалось много лет для разработки доступных методов культивирования клеток, а в них — вирусов. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусо­чек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут переживать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот спо­соб давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать усло­вия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться. К началу второй половины XX в. эпидемии полиомиелита приняли настолько широкий и опасный характер, что требовалось принять немедленные меры для создания вакцины, ко­торую можно было бы использовать для массового применения. Но для этого нужно было найти метод, позволяющий быстро выращивать вирусы в большом количе­стве. Это и явилось одним из обстоятельств, стимулировавших разработку мето­дов культивирования вирусов. Для получения культур клеток, которые можно бы­ло бы использовать для выращивания вирусов, необходимо было решить четыре главных проблемы:

1) получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

2) создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы актив­но размножаться;

3) обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножать­ся бактерии;

4) определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Все эти проблемы были решены. Для выделения изолированных, но жизнеспо­собных клеток из разрушенных тканей использовали обработку их слабым раство­ром трипсина, разрушающего межклеточные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размноже­ния клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и др.), ми­неральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добав­ляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размножении. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо об­работанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток обрабатывают ан­тибиотиками. Решающее значение имели опыты, проведенные в 1949 г. Дж. Эндерсом, Т. Веллером и Ф. Роббинсом, которые показали, что вирус полиомиелита хоро­шо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян.

Разработка способов получения культур клеток позволила широко внедрить в практическую медицину современные классические методы вирусологической ди­агностики инфекционных заболеваний, с одной стороны, и обеспечить накопление вирусов в количествах, достаточных для производства вакцин, с другой. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после не­скольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бес­конечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток получают из опухолевых тка­ней (НеLа, НЕр-2 и др.) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромо­сом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких кон- таминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требо­ваниям отвечают культуры диплоидных клеток. «Штаммом диплоидных клеток называется морфологигески однородная культура клеток, стабилизирован­ная в процессе культивирования in vitro, имеющая огранигенный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста (стабилизации, активного роста и старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной активностью при трансплантации хомячкам» (решение Симпозиума по дип­лоидным клеткам, Москва, 1971).

Как оказалось, вирусы могут размножаться не только в культурах клеток, обра­зующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.

Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в настоящее время используют чаще всего заражение куриных эмбрионов, первично-трипсинизиро­ванных и перевиваемых культур клеток.

Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное опреде­ление вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и по­крывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при температуре 37 °С. Через 48—96 ч выявляются пятна-бляш­ки. Они имеют диаметр 1—3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пят­на возникают за счет цитопатического действия вируса. Этот метод позволяет непо­средственно обнаруживать рост вирусов.

Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, — некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности кле­точных мембран, апоптоз — вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы. Установлено, что апоптоз играет важную роль в пато­генезе инфекций, вызываемых рядом РНК-содержащих вирусов (ретровирусов, миксовирусов, альфавирусов, буньявирусов, пикорнавирусов, флавивирусов).

 

Цитопатическое действие вирусов может проявляться в виде следующих изме­нений:

1) Равномерная мелкозернистая деструкция клеток (полиовирусы, вирусы Коксаки и др.).

2) Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток (вирус гриппа, клещевого энце­фалита и др.).

3) Гроздевидная дегенерация клеток (аденовирусы).

4) Крупнозернистая равномерная деструкция клеток (вирус герпеса).

5) Симпластообразование (респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори и другие).

О росте вирусов в клетках можно судить также по поведению индикатора, до­бавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В слу­чае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраня­ет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оран­жевый. Некоторые вирусы, в частности вирус гриппа, обладают особыми рецептора­ми (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживают­ся с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбиру­ются на инфицированных вирусами клетках культуры тканей, см. цв. вкл., рис. 79,1). Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции: преципитации в агаре, иммунофлуоресценции, РСК, ИФМ и пр., а также метод ДНК-зонда и заражение животных, чувствительных к данному вирусу.

 

4. Строение бактериофагов. Взаимодействие Т-фагов с микробной клеткой (адсорбция, проникновение фаговой ДНК в клетку, размножение фага и выход его из клетки). Лизогения и лизогенная конверсия, механизм. Практическое использо­вание фагов в медицине.

Бактериофаги— вирусы бактерий. Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушени­ем.

Поскольку естественной средой обитания лю­бого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями. Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо куби­ческой симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка — икосаэдр, хвостик — спиральная симметрия). Фаги разли­чаются по форме — нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам — мелкие, среднего размера и крупные. Чем крупнее фаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл.

 

Лизогения и лизогенная конверсия, механизм.

Жизненный цикл фага может проявляться в форме продуктивной (фаг размножа­ется в клетке и выходит из нее), редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки-хозя­ина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка стано­вится лизогенной) и абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клет­кой обрывается на какой-то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.

Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передаю­щийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вы­звать продуктивную форму инфекции.

Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки-хозяи­на, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости назы­вают лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Ли- зогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.

 

Взаимодействие Т-фагов с микробной клеткой:

1)Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфиче­ских рецепторов (белков-лоцманов), которые располагаются на кончике нити, ши­па или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом.

2)Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматиче- скую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).

3)Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации со­держащейся в геноме информации:

4)Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.

5)Сборка вновь синтезированных вирионов — заключение геномной НК в бел­ковую оболочку, морфогенез фагов.

6) Выход вновь синтезированных фагов из клетки:

а) путем отпочковывания;

б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вы­зывает гибель клетки.

Практическое применение фагов. Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги мо­гут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболе­ваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонел- лезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Фаги широко использу­ют для изучения генетики микроорганизмов.