Рекомбинация факторов фагоустойчивости, антибиотикоустойчивости и бактериоциногении

Одним из важных элементов в системе защиты заквасок от действия бактериофага является системная и систематическая ротация заквасок, использование многоштаммовых многокомпонентных заквасок, штаммы которых, как правило, не могут лизироваться одновременно. При этом целесообразно включать в закваску штаммы, отобранные по результатам теста на фагоустойчивость с индексом чувствительности выше 0,1 и различным фаготипом. При этом важна практическая работа по селекции штаммов – направленному отбору клонов (из природ источников, спонтанно- или мутагенно-образованных мутантов, рекомбинантов, полученных генетическими методами) по ряду свойств, определяющих их производственную ценность, в том числе по фагоустойчивости [ 33, 280, 296, 608 и др. ]. А использование ограниченного числа штаммов позволяет вести длительную работу по их генетическому изучению и регуляции активности генов, ответственных за фагоустойчивость [322.].

Таблица 2.3 – Плазмиды лактококков, содержащие детерминанты фагоустойчивости

Наименование плазмиды	Молекулярная масса, МДа	Характеристика механизма фагозащиты	Литературный источник
pIL6		R/M, К	[ Appl., 1985 ]
pTN20		R/M, К	[ Chopin A., 1984 ]
pLR1020		R/M, К	[ Higgins D., 1985, Appl., 1987 Klaenhammer J., 1987 ]
pSK112		Аd, К	[ Klaenhammer J.R., Sanozky Dawes R.B ]
pTR2030		Аb, преимущественно, к фагам форфотипаВ2, К	[De Vos W.M ., Hill C.,, Steenson L, Jarvis A]
pNp40		Аd, К	[ Mc Kay L ]
pC1750		Аd, К	[ Baumgartner A. ]
pC1829		Аd, К	[Daly C., Fitzgerald F]
pDU-80		Аb, К	[ Gasson M, 1990 ]
pAJ1106		Аb, к фагам морфотипов В1 и В2	[ Jarvis A.W. Conyugal, 1988 ]
pBF61		R/M	[ Vedamuthu E ]
pIL103		R/M	[ Gautier M. ]
pIL107		R/M	[ Gautier M. ]
pIL105		R/M Аb	[ Gautier M. ]]
pKR223		R/M, Аb, Аd	[ Vedamuthu E.R., Neville J.M ]

Примечание. R/M –механизм рестрикции-модификации, Аb – механизм абортивной инфекции, Аd – блокирование адсорбции, К – конъюгационная плазмида.

Известно, что штаммы лактококков, содержащие наборы плазмид, включающие обычно 4–7 кольцевых ковалентнозамкнутых молекул ДНК, часто содержат ген различного механизма фагоустойчивости (табл.2.3).

Как видно из табл. 2.3, гены фагоустойчивости плазмид контролируют три механизма фагозащиты бактериальной клетки, действующие на различных этапах литического цикла: в начале фаговой инфекции (подавление адсорбции фага); при введении фаговой ДНК в клетку (рестрикация-модификация чужеродной ДНК) и во время репликации фага (абортивная инфекция).

Один из способов передачи генетического материала от клетки-донора к клетке реципиента, успешно применяемый для молочнокислых микроорганизмов (лактококков и лактобцаилл), – коньюгация – осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой.

Способность быть донором определяется присутствием в бактериальной клетке коньюгативной плазмиды.

Неспособные к коньюгативному переносу плазмиды относят к неконьюгативным.

В составе генома коньюгативной плазмиды, молекулярная масса которой обычно превышает 25 МДа, имеется tra-оперон, гены которого осуществляют следующие функции [593]:

1) синтез половых волосков – пилей, которые необходимы донорной клетке для осуществления контакта с реципиентной клеткой,

2) синтез веществ, сводящих к минимуму возможные спаривания между собой клеток донора;

3) коньюгативный перенос собственной плазмиды или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного сайта (точки интеграции плазмиды ori Т);

4) вегетативная репликация автономной плазмиды;

5) контроль числа копий плазмиды на хромосому и контроль несовместимости родственных плазмид.

Неконьюгативные плазмиды не содержат детерминантов, придающих бактериальной клетке свойство генетического донора. Однако такие плазмиды могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Перенос коньюгативными плазмидами неконьюгативных называется мобилизацией. При этом неконьюгативная плазмида является мобилизуемой, а конъюгативная – мобилизующей. Наиболее важную роль в генетике молочнокислых и других грамположителъных бактерий сыграла мобилизующая конъюгативная бирепликонная плазмида с широким кругом хозяев рАМв I (26.5 т.п.н.), определяющая устойчивость к антибиотикам MLS-группы (эритромицину, линкомицину и др.), способная мобилизовать на перенос неконьюгативные плазмиды и бактериальную хромосому с частотой 10^–4 – 10^–8 [700, 705].

Процесс включения конъюгативной плазмиды в хромосому клетки, по-видимому, осуществляется в результате реципроктной рекомбинации по участкам гомологии между плазмидой и хромосомой. При этом образуются донорные клетки типа Hfr (High frequency of rekombination – высокая частота рекомбинации), способные с высокой частотой 10^–3 – 10^–4) передавать хромосомные гены в клетки реципиента. Этот процесс можно рассматривать как самоперенос конъюгативной плазмиды, в состав которой включена бактериальная хромосома [700].

Некоторые конъюгативные плазмиды обеспечивают конъюгативный перенос ДНК при выращивании штаммов донора и реципиента в жидкой среде, другие плазмиды более эффективно переносят детерминанты при скрещивании на агаризованной среде в чашках Петри или при контакте клеток на мембранных фильтрах, лежащих на питательном агаре [626, 366].

Многочисленные исследования показали, что частота трансмиссии плазмид зависит от времени контакта донора и реципиента, от фазы их роста и наиболее эффективна, если донор и реципиент находятся в логарифмической фазе роста [329].

Существует большая зависимость эффективности передачи маркеров от используемого реципиента. Чужеродные плазмиды не должны нарушать клеточные процессы реципиента [581] и быть совместимыми с уже существующими плазмидами.

Применение конъюгации при конструировании промышленных штаммов микроорганизмов позволяет получать генетические рекомбинанты, проводить мобилизацию неконьюгативных плазмид, создавать гибридные коитерированные) плазмиды, объединять различные плазмиды в одной клетке.

Имеются примеры конструирования методом коньюгации штаммов лактококков (в частности, с использованием маркеров антибиотикоустойчивости) с улучшенными отдельными производственно-ценными свойствами.

Получены трансконъюганты, обладающие улучшенной способностью к ферментации лактозы, со стабилизированной протеиназной активностью, с улучшенной способностью утилизировать цитрат, продуцирующие низин, устойчивые к нему, синтезирующие диплококцин; выявлен перенос Mus+ фенотипа (образование вязкого сгустка при культивировании в молоке) [601, 676, 688 и др. ].

Широкие конъюгативные возможности бирепликонных плазмид, подобных рАМв I, могут быть полезными для научных исследований, т.к. позволяют вводить плазмиды в клетки из различных промежуточных реципиентных штаммов, например, хорошо трансформируемых Е. coli.

При изучении нами возможности передичи плазмид в лактотокках использовались два варианта (табл. 2.4):

- конъюгативная двурепликонная плазмида pSB20mob, способная реплицироолваться в грамотрицательных и грамположительных бактериях;

- пары плазмид, одна из которых – конъюгативная плазмида Rp4, способная поддерживаться только в грамотрицательных микроорганизмах, например Е. сoli, а вторая неконъюгативная плазмида pLFRI (pLFYM2), способная реплицироваться в грамотрицательных и грамположительных бактериях и мобилизоваться с помощью Тра-генов Rp4.

Таблица 2.4 – Конъюгационный перенос (мобилизаия) из Е. сoli в лактококки [ Протасова (Полянская) ]

Донорный штамм Е. сoli/маркер	Реципиентный штамм/маркер	Трансконъюгант
S171 (pSB20mob)/Erm, 100 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 17/Sm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 17(pSB20mob)
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 17/Sm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 17(pLFYM2)
S171 (pSB20mob)/Erm, 100 мг/см3	Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. сremoris 613 (pSB20mob)
HB101(Rp4, pLFRI)/Cm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6/Sm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6 (pLFRI)
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6/Sm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6(pLFYM2)
HB101(Rp4, pLFRI)/Cm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 195/Sm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 195(pLFRI)
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 195/Sm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. lactis 195(pLFYM2)
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см3	Lactococcus lactis sp. сremoris 613(pLFYM2)

Среди реципиентных штаммов были штаммы лактококков, содержащие несколько плазмид разного молекулярного размера, обладающих производственно важными свойствами для использования их в качестве заквасочных: Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см³, Lactococcus lactis sp. lactis 195/Sm, 10 мг/см³, Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см³, а также бесплазмидный контрольный штамм Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6/Sm, 10 мг/см³.

Частота переноса плазмид pSB20mob, pLFYM2 составила от 10^–7 до 10^–6 на одну донорную клетку.

Табица. 2. 5 – Сравнительная кислотообразующая активность рекомбинантов и исходных культур

Культура	Титруемая кислотность, ºТ.(x±s), после инокуляции через
4 ч	24 ч
Lactococcus lactis sp. lactis 17	33±1	95±2
Lactococcus lactis sp. lactis 17(pLFYM2)	34±1	80±1
Lactococcus lactis sp. lactis 17(pSB20mob)	32±1	71±1

 

При проверке у рекомбинантов способности сбраживать лактозу, определяемую по способности свертывать молоко, все трансконъюганты подтвердили сохранение этого свойства после введения чужеродной бирепликонной плазмиды. Однако снизились и активность кислотообразования (по продолжительности свертывания молока, инокулируемого 5% культуры) с 8 до 12 час, и энергия кислотообразования (по приросту титруемой кислотности) (табл. 2.5).

Таким образом, по результатам рекомбинаций конъюгативной передачей (как наших, так и других иследователей) бирепликонных плазмид получаются жизнеспособные трансконъюганты, но большиство из них приобретают ухудшение некоторых производственных свойств, поэтому отбор производят по ведущему или нескольким ведущим признакам.

Следующим этапом исследований, имеющим практическую направленность получения более ценных по производственным признакам транс конъюгантов стала передача терминант антибиотикорезистентности из лактококков в лактококки [359)]. В большинстве случаев (например, табл. 3) при близкой частоте рекомбинации фагоспецифичность рекомбинантов осталась такой, как у одной из родительских культур.

Талбица 2.6 – Конъюгативная передача антибиотикорезистентности

Родительские культуры	Частота отбора рекомбинантных штаммов	Фаготип рекомбинантной культуры соответствует фаготипу
Lactococcus lactis sp. сremoris 93/Sm, 2000 мг/см3	Lactococcus lactis sp. diacetylactis 613/ Tс70 мг/см3,	10–7	Lactococcus lactis sp. diacetylactis 613/ Tс70 мг/см3,
Lactococcus lactis sp. lactis бесплазмидный/ Sm, 2000 мг/см3,	Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50 мг/см3,	10–7	Lactococcus lactis sp. lactis бесплазмидный/ Sm, 2000 мг/см3,

Предпринята попытка использовать в качестве маркера одной из родительских культур антибиотикоусточивость, а другой – фагоспецифичность. Полученный конъюгативной передачей штамм с двойной антибиотикоустойчивостью Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50, Sm, 2000 и культура Lactococcus lactis sp. diacetyllactis 613/6 скрещены, и отобран рекомбинантный клон на селективной среде, содержащий оба антибиотика и литическую смесь фагов, вирулентную по отношению к штамму Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50, Sm, 2000, в то же время негомологичную по отношению к Lactococcus lactis sp. diacetyllactis 613/6. Фаготипирование рекомбинантного клона выявило его устойчивость к ряду фагов литических по отношению к Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50, Sm, 2000.

Таким образом, показана принципиальная возможность использования маркеров антибиотикоустойчивости и фагоспецифичности и их комбинации для отбора трансконъюгантов производствено-ценных штаммов, т.к. признаки антибиотикоустойчивости и фагорезистентности, в большинстве случаев (в 19 из 20), не являются сцепленными. В дальнейших исследованиях [359] классические маркеры антибиотикоустойчивости, как снижающие в проведенных испытаниях кислотообразующую активность, заменены нами на маркеры фагоспецифичности.

Полученные нами методом генетической рекомбинации (конъюгативной передачей) штаммы лактококков с повышенной фагоустойчивостью обладали в около 30% случаев стабильностью приобретенного признака фагорезистентности и физиолого-биохимическими свойствами, позволяющими использовать рекомбинантные штаммы в качестве заквасочных. По результатам данной работы отобрано и передано на Угличскую биофабрику 8 рекомбинантных культур лактококков с повышенной фагоустойчивостью, сохранивших свои свойства в течение длительного времени использования в составе БП для сыров.

В настоящее время с применением методов генной инженерии проводятся также исследования, направленные на получение штаммов-продуцентов бактериоцинов с заданными свойствами. В качестве примера получения бактериоцина генноинженерным способом можно указать на работу по выделению и идентификации гена, кодирующего биосинтез бактериоцинов в культуре Pediococcus acidilactici. Указанный ген клонирован в составе векторной плазмиды PSPQ11 и трансформирован в полученную рекомбинантную плазмиду E.coli. Полученный бактериоцин предполагают использовать для подавления роста бактерий рода Listeria в пищевых продуктах [641].

Описаны новые биологически активные гибридные бактериоцины, сконструированные путем объединения областей из различных педиоцино-подобных бактериоцинов. Известно, что бактериоцины, продуцируемые молочнокислыми бактериями и относящиеся к семейству педиоцинов, состоят из двух модулей: гидрофильного консервативного N-концевого и более вариабельного гидрофобного С-концевого. Применение методов генной инженерии позволило сконструировать четыре новых гибридных бактериоцина, обладающих биологической активностью и специфичностью в отношении различных штаммов бактерий, сходной со специфичностью родительского бактериоцина, от которого взят С-концевой фрагмент. Сделан вывод, что у педиоциноподобных бактериоцинов специфичность к клетке-мишени определяется С-концевым фрагментом [569].

Таким образом, многочисленные работы, в т.ч. наши исследования в области конъюгационного переноса, позволяют надеяться на возможность практического применения конъюгации для селекции штаммов пробиотических и входящих в состав ПФП микроорганизмов с повышенной фагоустойчивостью и антибиотической активностью, обладающих, по сравнению с естественной селекцией, большей эффективностью. В то же время, необходимо учитывать комплексный подход отбора производственно-ценных рекомбинантных штаммов, применительно к пробиотикам, и ограничения, накладываемые на использование рекомбинантных клонов (в случае их антибиотикоустойчивости) в производстве продукта питания.