Непрямые (пассивные) реакции агглютинации.

Эти реакции называются непрямыми (пассивными), т.к. при их проведении используют антигены (или антитела), искусственно адсорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц.

Реакция непрямой (пассивной) агглютинации основана на способности клеток (эритроцитов) или некоторых химических частиц (латекс) адсорбировать на своей поверхности антигены и гаптены бактерий, антигены вирусов, риккетсий. При этом носитель приобретает новую антигенную специфичность и вступает во взаимодействие с имунными сыворотками, специфичными для адсорбированного антигена.

Для получения сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарных диагностикумов), их обрабатывают танином, что повышает их адсорбционную способность.

Можно адсорбировать на сенсибилизированных эритроцитах не только антигены, но и специфические антитела. Такие препараты называют антительными эритроцитарными диагностикумами. Постановка реакции агглютинации с таким диагностикумом называется обратной РНГА (или РОНГА).

Антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы широко используются для постановки непрямой реакции гемагглютинации.

РНГА обычно ставят на плексигласовых планшетках с лунками. Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56°С в течение 30 минут для разрушения комплемента и разводят от 1:10 до 1:12 000 и более, разливают в лунки до 0,5 мл и добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума. Реакцию выдерживают в течение двух часов в термостате и считают положительной, если осадок эритроцитов имеет форму "зонтика" с зубчатыми краями и покрывает почти все дно лунки. При отрицательном результате эритроциты оседают в центре дна лунки в виде компактного диска с ровными краями (см. демонстрацию).

Непрямые варианты реакции агглютинации делают ее более чувствительным методом и расширяют возможности ее применения. Реакции этого типа широко применяются для диагностики инфекционных заболеваний (выявление специфических антител в сыворотке больного при брюшном тифе, туляремии, гриппе, риккетсиозах, хламидиозах), а также для определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления лекарственной аллергии, определения поствакцинального иммунитета при дифтерии и т.д.

Реакция преципитации (РП) - осаждение высокодисперсных антигенов (в коллоидном состоянии) - специфическими антителами (преципи-тинами) в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается, если эти ингредиенты находятся в эквивалентных количествах. Антиген в реакция преципитации должен быть прозрачным.

Реакцию преципитации ставят с целью выявления антигена по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела.

Для приготовления коллоидных антигенов, участвующихв реакции преципитации, используют различные методы их экстракциииз исследуемого материала: физические, химические и биологические. Бактериальный антиген может быть получен путем его экстрагирования из чистых культур бактерий, из патологического материала или из объектов внешней среды, обсемененных микробами (диагностика сибирской язвы, чумы, туляремии). В судебно-медицинской практике с помощью реакция преципитации определяют видовую специфичность белка (крови, спермы), в санитарной практике - выявляют фальсификацию пищевых продуктов, в клинической иммунологии - уровень имунноглобулинов в сыворотке крови. Таким образом, знание этой реакции необходимо для врачей многих специальностей.

При постановке РП разводят не сыворотку, а антиген. За титр преципи-тирущей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии со стандартной иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата.

Существует несколько вариантов постановки реакции преципитации:

Реакция кольцепреципитации: на слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый антиген и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата. Широкое распространение получила реакция термопреципитации (р.Асколи) на антиген возбудителя сибирской язвы, использующая антигены, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья.

Реакция микропреципитации применяют для выявления низких титров антител. При ее постановке в исследуемую сыворотку крови вносят антиген в убывающей концентрации; при отсутствии антител разведение сыворотки крови антиген уменьшает ее оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств антител образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды (учет результатов осуществляется нефелометрическим методом).

Реакция флокуляции - это РП в системах токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Проявляется появлением хлопьевидного осадка. Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксических сывороток.

РП в геле (иммунодиффузия) в различных модификациях: простая иммунодиффузия (по Уанье), встречная иммунодиффузия (по Оухтерлони), радиальная иммунодиффузия (по Манчини).

Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесенного сверху в лунки или пробирки с агаром, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной (встречной) диффузии Аг и Ат вносят в отдельные лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Иммуноэлектрофорез. Метод объединяет РП в геле с элетрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре - разделяющую их канавку. В лунки вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1-2 часов, различные Аг с разной скоростью перемещаются между катодом («старт») и анодом («финиш»). Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и, в случае положительного результата, в геле образуются зоны преципитации.

Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении антигенов со специфическими антителами, меченными флюорохромными красителями, благодаря чему с помощью люминесцентного микроскопа эти антиге­ны (связанные с антителами) выявляются в виде светящихся изображений на несветящемся фоне препарата.

Основная сложность метода заключается в изготовлении люминесци-рующих (флюорохромных) сывороток. Для этого из исходной иммунной сыворотки выделяют и концентрируют глобулиновую фракцию (антитела), которая соединяется с флюорохромом (например, изотиоцианатом или другим хроматографически чистым красителелем).

При проведении исследований применяют прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции. При прямом методе готовят препарат, содержащий исследуемые антигены (мазок из патологического материала, крови, отпечаток или срез различных органов и тканей, и др. материалы, содержащие микроорганизмы), фиксируют его жидким фиксатором и обрабатывают специфическим люминесцирующим иммуноглобулином. После инкубации отмытый от избытка иммуноглобулина и высушенный препарат рассматривают в люминесцентный микроскоп, возбуждая свечение ультрафиолетовым светом. Светящиеся изображения антигенов будут наблюдаться только при соответствии их взятому меченому иммунноглобулину.

Прямой метод технически прост и высокоспецифичен, но требует большого набора различных люминесцирующих иммуноглобулинов (на каждый антиген - отдельная специфическая сыворотка).

При непрямом методе препарат, приготовленный таким же образом, обрабатывают обычной (несветящейся) специфической сывороткой (полученной путем иммунизации кролика), промывают буферным раствором и затем заливают люминесцирующую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов кролика) и снова промывают. При микроскопии видны светящиеся изображения антигена, если он соответствует взятой иммунной сыворотке, так как в этом случае к образовавшемуся комплексу антиген + антитело присоединяется люминесцирующая антиглобулиновая сыворотка. Следовательно, при непрямом методе иммунная сыворотка (в нашем случае кроличья) служит антителом для исследуемого антигена и, в свою очередь, является антигеном для соответствующей антиглобулиновой люминесцирующей сыворотки (содержащую антитела против иммуноглобулинов кролика, меченные флюорохромом). С помощью непрямого метода можно определять также наличие антител в сыворотках.

В практической микробиологии и вирусологии ИФ-метод является методом экспресс-диагностики многих инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы.

Метод иммобилизации основан на обездвиживании подвижных микроорганизмов под действием специфических антител, например бледных трепонем при диагностике сифилиса.

Метод нейтрализации токсина антитоксином является биологическим методом, так как выполняется на лабораторных животных (чаще всего на мышах) и основан на исчезновении токсических (летальных) свойств исследуемого материала (например, при ботулиническом отравлении, при газовой гангрене) после добавлении к нему специфических антител.

 

Цели занятия:

1. Изучить механизмы взаимодействия антиген-антитело: принципы и методы постановки реакций агглютинации, преципитации и иммунофлюоресценции.

2. Уметь интерпретировать результаты серологических исследований.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Реакции антиген-антитело: реакции прямой (ориентировочную и развернутую) и непрямой агглютинации (РНГА, РОНГА, р. Кумбса).

2. Реакции преципитации (кольцепреципитации, р.Асколи, микропреципитации, р. флокуляции, р. Манчини).

3. Р.иммобилизации, р. нейтрализации токсина,р. прямой и непрямой иммунофлуоресценции.

 

Уметь:

1. Учесть и оценить результаты серологических реакций.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Постановка реакции агглюцинации на предметном стекле для идентификации неизвестной культуры микробов по антигенным свойствам. Необходимо иметь: диагностическую агглютинирующую сыворотку, испытываемую культуру на МПА, физиологический раствор.

На одну половину предметного стекла нанести каплю диагностической сыворотки в разведении 1/10, на другую - каплю физиологического раствора (контроль). Петлей взять исследуемую культуру с МПА и внести ее сначала в каплю с физиологическим раствором, потом в каплю с иммунной сывороткой. Покачивая стекло, равномерно распределить ингредиенты реакции. Склеивание происходит в течение первых минут наблюдения, когда при покачивании стекла в мутной капле образуются хлопья (зернышки), которые, укрупняясь, перемещаются к периферии. В контрольной капле остается равномерная муть.

2. Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках в целях установления титра агглютинирующей сыворотки. Необходимо иметь:

• агглютинирующую сыворотку для титрования;

• взвесь убитых микробов (диагностикум), специфичную для данной сыворотки;

• физиологический раствор.

 

Таблица 1. Титрование диагностигностической агглютинирующей сыворотки

№№ пробирок
Разведение сыворотки	1/1000		1/2000		1/4000		1/8000		1/16000	RК
Ингредиенты реакции
1. Физ. раствор (в мл)	1,0		1,0		1,0		1,0		1,0	1,0
2.Аггл. сыворотка в разведении 1:500 (в мл)	1,0	1,0 → →	(1,0)	1,0→ →	(1,0)	1,0 → →	(1,0)	1,0→ →	(1,0)
3. Диагностикум (в каплях
Учет результата

Агглютинирующую сыворотку добавляют в первую пробирку и затем переливают 1 мл разведенной сыворотки во 2 пробирку, затем из 2 в третью и т.д. Из 5 пробирки удаляют 1 мл смеси (в дез.р-р) для сохранения определенного объема. Штатив с пробирками помещаем в термостат на 2 часа, после чего учитываем предварительный результат. Окончательный результат учитывается через 24 часа, после пребывания реакции при комнатной температуре.

При отсутствии агглютинации жидкость остается равномерно мутной, при полной агглютинации образуются хлопья агглютината в прозрачной жидкости.

За титр агглютинирующей сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором происходит агглютинация

3. Постановка реакции кольцепреципитации в целях определения видовой специфичности белка крови. Необходимо иметь: ткань с кровяным пятном, преципитирующие сыворотки к белку человека, курицы, свиньи и др., физиологический раствор.

а) приготовление преципитиногена для постановки реакции путем экстрагирования белка крови из кровяного пятна с помощью физраствора, фильтруем антиген через бумажные фильтры.

б) техника постановки реакции кольцепреципитации: в узкие пробирки (диаметром 0,5см) вносят 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем тонкой пастеровской пипеткой по стеклу осторожно держа пробирку в наклоненном положении, наслаиваем 0,2 мл раствора антигена. Пробирку переводим в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 минуты. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде белого кольца. В контроле (норм. сыворотка + антиген) преципитата нет.

4. Постановка реакции преципитации в геле, поставленной в целях определения токсигенности дифтерийных культур (реакция Илека).

На чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтрованной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. На расстоянии 0,6 - 0,8 см от края полоски засевают методом бляшек исследуемые культуры дифтерийной палочки. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуется линия преципитации в виде дуги.

 

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Развёрнутая реакция агглютинации в пробирках. "О" и "Н" - аплютинация.

2. РНГА на планшетках.

3. Реакция преципитации в геле, поставленная в целях определения токсигенности дифтерийных культур.

4. Реакция преципитации в геле, поставленная в целях определения иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини).

5. Наборы диагностикумов, антигенов, иммунных сывороток, флюо-ресцерующих гаммаглобулинов.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле в целях изучения антигенных свойств культуры микробов.

2. Поставить развёрнутую реакцию агглютинации в пробирках для определения титра агглютинирующей сыворотки.

3. Приготовить антиген для реакции преципитации и поставить реакцию кольцепреципитации для определения видовой специфичности белка крови, учесть результат, сделать заключение.

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Реакции иммунитета: две фазы реакции, характеристика.

2. Реакция агглютинации: участники реакции, их характеристика, методы постановки реакции, практическое применение реакции агглютинации.

3. Какие модификации позволяют повысить чувствительность реакции агглютинации?

4. Что такое диагностикум, для чего он применяется? Как приготовить О- Н- и Vi - диагностикумы и антительный диагностикум?

5. В чем заключается методика постановки реакции агглютинации на предметном стекле и развернутой реакции в пробирках?

6. Что такое коагглютинация, когда она применяется?

7. Как ставится реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации, ее сущность, постановка, методика постановки, практическое применение.

8. Реакция Кумбса для выявления неполных антител, ее сущность.

9. Реакция преципитации: ингредиенты, их характеристика, механизм, методы постановки, практическое использование.

10. Техника постановки реакции кольцепреципитации. В каких случаях она применяется?

11. Сущность реакции преципитации в агаре. В чем преимущество преципитации в агаре по сравнению с кольцепреципитацией?

12. Понятие об иммуноэлектрофорезе: сущность, применение.

13. Метод иммунофлюоресценции: прямой и непрямой методы ЛФ, сущность, практическое использование.

14. В чем заключается серологический метод иммобилизации? В каких случаях он применяется?

15. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Сущность. Практическое использование.

 

ЗАНЯТИЕ №14

Темы: