Методы создания анаэробных условий

Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Кита - Тароцци, которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по методам Вейнберга и Веньяль-Вейона. Культивировать анаэробы Вейнберг предложил на сахарном агаре столбиком. Агар с глюкозой наливают в пробирку высоким столбиком до 2/3 их объема, охлаждают до 42 - 45°С. Исследуемый материал добавляют в агар, тщательно перемешивают. Пробирку ставят в штатив, питательная среда застывает и внутри нее (особенно в ниж­ней части пробирки) создаются надежные анаэробные условия.

Метод Веньяль-Вейона состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Веньяль-Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механического откачивания их специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, СО2) можно производить в анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия NA2S2O4.

Биологические методы (метод Фортнера). Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается 2 агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 суток). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.