1. Выявление включений волютина у дифтерийной палочки – Corynebacterium diphtheriae(окраска по Нейссеру – рис.14, см. приложение). Микробные клетки желто-зеленого цвета, на полюсах видны включения волютина темно-синего, почти черного цвета; расположение микроорганизмов в виде пальцев растопыренной кисти, римских цифр V и X.
2. Изучение клеточной стенки у дрожжей (Saccharomyces сerevisiae - демонстрационный препарат). Окраске мазка дрожжей концентрированным раствором генциан-фиолетового красителя предшествовал плазмолиз клеток в гипертоническом растворе NaCl и протрава танином. Клеточная стенка выглядит темным двуконтурным розовато-сиреневым ободком вокруг светлой цитоплазмы (рис. 15, см. приложение).
З. Бактериальный нуклеоид у сенной палочки (Bacillus subtilis - демонстрационный препарат – рис. 16, см. приложение). Окраска по Романовскому - Гимза. Зернышки хроматина полиморфные, рубиново-красного цвета; цитоплазма - лилово-синего цвета.
4. Выявление капсул у Klebsiella pneumonae. Окраска препарата по Гинсу-Бурри (рис. 17, см. приложение). Видны окрашенные в красный цвет диплококки, окруженные прозрачной зоной неокрасившейся цитоплазмы.
5. Окраска кислотоустойчивых бактерий (возбудитель туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis). Окраска по Цилю-Нильсену (рис. 18, см. приложение). На голубоватом фоне препарата видны ядра клеток и микобактерии, окрашенные в рубиново-красный цвет.
6. Окраска спор Bacillus cereus. Окраска модифицированным методом Ауески. Выполняется окраска по методу Циля-Нильсена, однако обесцвечивание проводится 0,5% HCl. Необходимо избегать грубой фиксации мазка над пламенем. Вегетативные клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, споры - в ярко-малиновый (рис. 19, см. приложение).
Тема 3. МОРФОЛОГИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ, СПИРОХЕТ, РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ, МИКОПЛАЗМ И АКТИНОМИЦЕТОВ.
Цель занятия: знакомство со специальными методами микроскопии, структурой жгутиков и пилей, методами окраски жгутиков и выявления подвижности у бактерий, использованием бактериоскопического метода в диагностике инфекций
Перечень конкретных учебно-целевых вопросов
1. Жгутики и пили. Их структура и функции. Способы изучения подвижности бактерий. Методы окраски жгутиков.
2. Сущность методов темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. Их использование в микробиологии.
3. Сущность методов люминесцентной и электронной микроскопии. Их применение в микробиологии.
4. Морфология и классификация спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм и актиномицетов. Методы их окраски.
5. Бактериоскопический метод исследования в микробиологии и его использование в диагностике инфекционных заболеваний.
ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ
Жгутики являются органами движения у многих бактерий, представляя собой очень тонкие (0,02—0,05 мкм) невидимые в обычный световой микроскоп нити, состоящие из сократительного белка флагеллина. По количеству и расположению жгутиков все подвижные бактерии подразделяются на следующие типы: а) монотрихи — имеют один жгутик на одном из концов клетки; б) амфитрихи - по одному жгутику на концах палочки; в) лофотрихи - пучок жгутиков на одном конце и г) перитрихи - большое количество жгутиков по периметру клетки. Диаметр жгутиков намного меньше разрешающей способности светового микроскопа, поэтому для их обнаружения пользуются или специальными методами окраски (предварительное протравливание мазка танином для того, чтобы вызвать набухание жгутиков, с последующей импрегнацией препарата), или изучают их при помощи электронного микроскопа жгутиков.
Наличие или отсутствие жгутиков у ряда бактерий является дифференциально-диагностическим признаком. Однако в связи со значительными трудностями обнаружения жгутиков и низкой воспроизводимостью метода их окраски, в практической работе наличие жгутиков оценивают путем изучения активной подвижности бактерий в живых неокрашенных препаратах.
Техника приготовления препаратов «раздавленная» и «висячая» капли для изучения подвижности микроорганизмов. Для изготовления препарата «висячей» капли взятую петлей или пастеровской пипеткой каплю суточной бульонной культуры наносят в центр покровного стекла, после чего накладывают его каплей вниз на стекло с лункой, края которой предварительно слегка смазывают вазелином. Капля не должна касаться краев лунки. При приготовлении «раздавленной» капли на предметное стекло наносят небольшую каплю культуры, которую покрывают покровным стеклом.
Микроскопию живых препаратов («висячая» или «раздавленная» капли) производят с сильной сухой (х40) или иммерсионной системой при несколько затемненном поле зрения (немного прикрыть диафрагму и опустить конденсор). Для изучения подвижности микробов можно пользоваться фазово-контрастной или темнопольной микроскопией.
У некоторых бактерий поверхность покрыта нежными ворсинками – пилями или фимбриями, которые могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии. Пили обеспечивают прилипание бактерий к питательным веществам или клеткам хозяина, а также принимают участие в половом процессе у бактерий – конъюгации.
Спирохеты в морфологическом отношении представляют собой тонкие извитые нити, обладающие активной подвижностью, размеры которых колеблются в широких пределах в зависимости от вида (длина 10-50 мкм, диаметр 0,1-0,6 мкм, патогенные виды имеют длину 3-20 мкм). Цитоплазма спирохет покрыта цитоплазматической мембраной, снаружи которой имеется нежная оболочка из тонкого пептидогликана. Между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной располагаются закрученные вокруг тела спирохеты фибриллы, придающие ей извитую форму и обеспечивающие движение. Различные виды спирохет отличаются друг от друга по форме, размерам, характеру подвижности и другим признакам.
Патогенные спирохеты (рис. 20) относятся к родам Treponema (9-12 равномерных завитков), Borrelia (7-9 неравномерных завитков), Leptospira (тонкие первичные завитки, вторичные завитки при движении в виде букв С или S). Для окраски спирохет применяют метод Романовского— Гимзы (боррелии и лептоспиры – фиолетового цвета, трепонемы – бледно-розового).
|
Спирохеты можно выявить также в препаратах, окрашенных по Бурри (негативный метод) или в «висячей» и «раздавленной» каплях. Препараты из живых спирохет исследуют с помощью темнопольной или фазово-контрастной микроскопии, позволяющие наблюдать особенности морфологии и движения спирохет.
| Рис. 20. Спирохеты. а – трепонемы, б –боррелии в – лептоспиры |
Актиномицеты - грамположительные бактерии, характеризующиеся наличием хорошо развитого ветвящегося мицелия, состоящего из одноклеточных нитей (гиф), шириной 0,3—0,8 мкм, длиной — до 600 мкм (рис. 21, см. приложение). Размножаются актиномицеты спорами или путем фрагментации мицелия. Актиномицеты имеют ряд признаков, общих с грибами. Выделяют низшие и высшие формы актиномицетов. Высшие формы образуют мицелий, врастающий в питательную среду (субстратный мицелий), развиваться над ней в виде рыхлого слоя -воздушного мицелия. На концах гиф воздушного мицелия (спороносцах), формируются споры, с помощью которых актиномицеты размножаются. К низшим актиномицетам относят кислотоустойчивые микобактерии (возбудители туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis и проказы - М. leprae), а также микококки. К этой группе микроорганизмов близки коринебактерии - короткие, полиморфные палочки в форме булавы или гантелей (патогенный вид - Corynebacterium diphtheriae, возбудитель дифтерии).
Риккетсии (класс Rickettsias) - группа бактерий, основной особенностью которых является облигатный (безусловный) паразитизм. На обычных питательных средах эти микроорганизмы размножаться не способны, поэтому для их культивирования в лабораторных условиях используют куриные эмбрионы или культуры тканей млекопитающих. Риккетсии полиморфны (рис.22, см. приложение), имеют кокковидную, палочковидную и нитевидную формы, мелкие размеры (диаметр кокковидных форм - 0,2—0,5 мкм, палочковидных форм 1—1,5 или 3—4 мкм, нитевидных - 10—40 мкм). Риккетсии размножаются простым делением, неподвижны, не образуют спор, капсул, окрашивают их обычно по Романовскому — Гимзе и Здродовскому. Риккетсии могут вызывать различные заболевания человека и животных - риккетсиозы.
Хламидии также относятся к облигатным внутриклеточным паразитам. Имеют палочковидную или сферическую форму, очень малые размеры (0,2—1,3 мкм). Размножаются делением, процессу деления предшествует образование вокруг частицы хламидий капсулы, напоминающей бактериальную. Хламидии окрашиваются по Граму отрицательно, чаще применяется метод Романовского-Гимза. Вызывают у человека трахому, паховый лимфогранулематоз, орнитоз, урогенитальную инфекцию.
Микоплазмы (класс Mollicutes) - мелкие (125-250 нм) полиморфные микроорганизмы в виде сферических тел, бус или нитевидных ветвистых форм, характеризующиеся отсутствием оболочки, вследствие чего они не имеют постоянной формы, не чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам, действующим на синтез оболочки. Микоплазмы размножаются делением, очень требовательны к питательным средам. Для изучения морфологии микоплазм пользуются фазово-контрастной микроскопией. Некоторые бактерии (кокки, микобактерии) под влиянием пенициллина и других веществ могут образовывать формы, лишенные оболочки - L-формы, которые по морфологическим и физиологическим свойствам близки к микоплазмам.
