Гетерохроматин и эухроматин.

 

Упоминаемый ранее порядок чередования поперечных тёмных и светлых сегментов, образующийся при дифференциальной окраске хромосом, связан с различной степенью конденсации хроматина, зависящей от его функционального состояния. Гетерохроматиновые участки функционально менее активны, чем эухроматиновые. Они содержат прочитанную (транскрибированную) ДНК, становятся более плотными и хорошо окрашиваются как в состоянии «покоя» так и при делении клетки. Эухроматиновые участки деконденсированы, т. е. более рыхлые, в них локализована большая часть генов, это активный участок хромосомы, окрашивается неинтенсивно. В хромосомах участки эу- и гетерохроматина чередуются и позволяют сделать анализ кариотипа, чтобы выявить нарушения, которые могут приводить к аномалиям развития, наследственным болезням или гибели плодов и эмбрионов на ранних стадиях развития.

Анализ кариотипа предполагает составление кариограммы или идиограммы – это систематизированный кариотип, в котором хромосомы располагаются по мере убывания их величины. Кариограмма – микрофотография хромосом, расположенных согласно строению и величине гомологичными парами.

Техника подсчёта числа хромосом.

Взятую для анализа кровь разделяют: эритроциты осаждают 10%-ным раствором желатина или центрифугированием; лейкоциты помещают в специальную среду, содержащую 50 ингридиентов. Среди которых есть специфический белок фитогемагглютинин – вытяжка из семян бобовых. Благодаря ему лейкоциты начинают интенсивно делиться и хромосомы можно изучать на стадии метафазной пластинки. Культуру помещают в термостат в специальных флаконах на 3 дня при 37⁰ С. Потом в пробу добавляют алколоид колхицин, разрушающий нити веретена деления, деление приостанавливается, хромосомы не способны расходиться к полюсам клетки. Добавляют гипотонический раствор, проводят фиксацию и окрашивание. Затем хромосомы фотографируют, микрофотографию увеличивают в размерах, хромосомы вырезают, подбирают гомологичные пары по размерам, расположению центромеры, гетеро- и эухроматиновым участкам.

 

6. Половой хроматин.

 

Различия полов обусловлены Х и У хромосомами (половыми). Половые отличия в строении ядер соматических клеток обнаружили в 1949 г. Бертрам и Барр, изучая нейроны кошки. Эти отличия присущи клеткам всех млекопитающих в период интерфазы. Интерфазные ядра содержат на переферии чечевицеподобные глыбки хроматина размерами от 1,8 до 1,2 мкм, примыкающие к ядерной оболочке и отличающиеся от ядрышек. Их назвали по имени исследователя «тельца Барра». Тельца Барра отсутствуют у самцов. Лейкоциты женщин содержат своеобразный придаток ядра, гомолог телец Барра, «барабанные палочки». Это - половой хроматин. Его наличие в клетках женщин связано с Х-хромосомами, которых у женщин две. Одна из них генетически менее активная, синтез ДНК в ней идёт позднее, она гетерохроматичная, окрашивается иначе, чем её гомолог. У мужчин половые хромосомы разные – Х и У, и они обе одинаково активны в интерфазе.

Хроматин половой – это отличия в интерфазном ядре соматических клеток особей женского пола у млекопитающих. По периферии ядер располагается глыбка хроматина – «тельце Барра», а в ядрах лимфоцитов находится придаток «барабанная палочка». У человека «тельца Барра» легче обнаружить в соскобе эпителия слизистой оболочки ротовой полости (буккального эпителия). Для выявления Х-хроматина окрашивание мазков проводят ацеторсеином и препараты просматривают в обычном световом микроскопе. Этот метод позволяет определить количество Х-хромосом в кариотипе. «Телец Барра» и «барабанных палочек» всегда на единицу меньше, чем число Х-хромосом.

Техника исследования полового хроматина - см. стр. 50 пособие по генетике Карузиной.

Исследования полового хроматина имеют диагностическое значение и используются при экспресс-анализе в скрининге. При обследовании больших групп людей на выявление каких-либо состояний (болезней или носительства) с целью активной профилактики тяжелых форм болезней, т. е. предположительного выявления не диагностированной ранее болезни с помощью простых методов, дающих быстрый ответ - массовый скрининг.

 

7. Современные методы хромосомного анализа.

 

Изучением строения и функций хромосом занимается наука цитогенетика. Суть цитогенетических методов при всём разнообразии отдельных этапов заключается в микроскопическом анализе хромосом, позволяющем выявить числовые и структурные изменения хромосомного набора. Методы цитогенетического исследования можно условно подразделить на прямые и непрямые. Прямые методы – это получение препаратов делящихся клеток без культивирования. Непрямые – это получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах.

Важный момент для анализа хромосом является их окрашивание:

1) сплошное или равномерное рутинное окрашивание (красители азур-эозин или краситель Гимза), позволяет провести подсчёт хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждения хромосом (хромосомные аберрции), но не позволяет провести индивидуальную идентификацию хромосом;

2) метод дифференциального окрашивания хромосом (красители Гимза, флуоресцирующий краситель акрихин или акрихин-пирит), позволяет идентифицировать все хромосомы благодаря линейному рисунку – продольной окрашиваемости для каждой хромосомы в соответствии с типом окраски;

3) молекулярно-цитогенетический метод гибридизации (флуоресцентная гибридизация), основана на обработке препаратов хромосом специфическим ДНК-зондом, который присоединяется к исследуемой хромосоме и, после обработки специальными соединениями и флуоресцентными красителями, препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа; это самый высокий разрешающий уровень анализа хромосом, позволяющий определить локализацию гена и расшифровать сложные перестройки хромосом.

Методы цитогенетической диагностики часто используют в комплексе с другими, что позволяет более точно диагностировать сложные проявления наследственной патологии. Особое значение эти методы имеют при оказании помощи больным педиатрического, акушерско-гинекологического и эндокринологического профилей.

Все вопросы назначения того или иного цитогенетического исследования осуществляются при медико-генетическом консультировании. Проблемы, решаемые лабораторными цитогенетическими методами, следующие:

-подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике;

-наличие у ребёнка множественных врождённых пороков развития (МВПР);

-многократные спонтанные аборты, мёртворождения или рождение детей с пороками развития;

-нарушение репродуктивной функции неясного генеза у мужчин и женщин (первичная аминоррея, бесплодный брак идр.);

-существенная задержка умственного и физического развития ребёнка;

-пренатальная диагностика (риск по возрасту, при рождении предыдущего ребёнка с хромосомной болезнью);

-оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических).

Участие цитогенетиков в анализе трудных случаев приводит к более точной диагностике и своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребёнка.

 

Вопросы для фронтального опроса.

1. Генетика – наука о наследственности и изменчивости.

-Предмет, цели и задачи медицинской генетики. Методы генетики?

-Значение генетики для медицины? (Овладение основами медгенетики широкими врачебными кругами с целью большего использования генетических подходов при диагностике болезней, их лечении и профилактике.)

-Медицинская генетика как раздел антропогенетики, одна из отраслей здравоохранения, её достижения?

2. История генетики человека.

-Донаучные представления о передаваемых по наследству различиях между людьми?

-Современные достижения генетики?

3. Цитологические основы наследственности.

-Главные части клеток. Клетки соматические и генеративные, половые клетки – гаметы. Хромосомный набор соматических и половых клеток?

-Основные типы деления эукариотических клеток (митоз, мейоз, амитоз)?

-Материальные носители наследственности?

-Что такое митотический цикл?

-Кариотип, кариограмма?

-Хромосомы в метафазу, метафазная пластинка? Хроматин. Понятие о гетерохроматине и эухроматине.

-Половой хроматин. Диагностическое значение исследования полового хроматина. -Различия полов, половые отличия в строении ядер соматических клеток млекопитающих, тельца Барра?

-Современные методы хромосомного анализа? Методы дифференциальной окраски хромосом. В чём их суть?

-Пренатальная диагностика, массовый скрининг?