Биоинформатическая база данных RegPrecise (http://regprecise.lbl.gov), предсказывающая сайты связывания белков-регуляторов транскрипции в геномах прокариот, свидетельствует о наличии 24 гипотетических Fur-боксов в промоторных областях 29 генов Synechocystis 6803, часть которых входит или может входить в состав оперонов. Гены предполагаемого fur -регулона можно разделить на 4 группы. Первая группа включает 5 генов, кодирующих белки фотосинтеза: 2 гена psbA (slr1181 и sll1867), 2 гена оперона psbDC и ген chlL. Вторая группа состоит из 2 генов стрессовых белков клетки: регулятора perR (гомолог гена fur) стрессового ответа на гидропероксидный стресс и гена isiA, кодирующий белок антистрессовой защиты фотосистемы I. Третья группа включает 15 генов известных или предполагаемых систем транспорта железа: 2 гена системы транспорта двухвалентных ионов железа (feoA и feoB), 2 гена основной системы транспорта трехвалентных ионов железа (futA1 и futA2) и 11 генов, кодирующих компоненты предполагаемых систем транспорта сидерофоров, которые входят в состав одного кластера генов в хромосоме Synechocystis 6803 (рис. 5Б). Четвертая группа состоит из 5 генов, кодирующих белки с неизвестной функцией: sll1911, sll1203, sll1407, slr1485 и pcrR, кодирующего предполагаемый транскрипционный фактор семейства AraC. Следует отметить, что 4 гена sll1203, sll1407, slr1485 и pcrR с неизвестной функцией входят в состав одного кластера с генами предполагаемых систем транспорта сидерофоров (рис. 5Б).
Упомянутый кластер генов является объектом активного изучения нашей лаборатории. К настоящему времени показано, что практически все гены кластера, включая гены компонентов предполагаемых систем транспорта сидерофоров, гены белков-регуляторов семейства AraC, а также гены с неизвестной функцией индуцируются в ответ на недостаток железа в клетке. Наличие гипотетических Fur-боксов в промоторных областях ряда генов кластера позволяет предполагать, что экспрессия соответствующих генов зависит от функции гена fur. Для проверки этого предположения был поставлен предварительный опыт по оценке изменения экспрессии нескольких генов кластера у штамма CuFur при сверхэкспрессии гена fur. С помощью ПЦР в реальном времени было измерено относительное содержание транскриптов генов fecD, fecE, fhuA2 и exbB у штамма CuFur в сравнении со штаммом ДТ при выращивании клеток в среде без добавления меди. Как видно из данных, приведенных в табл. 3, экспрессия гена fur, контролируемого промотором P petJ, повышается в отсутствии меди в клетках штамма CuFur (в 10 раз относительно штамма ДТ). Вместе с тем у этого штамма выявлено существенное снижение экспрессии трех генов кластера: fecE (болеечем в 10 раз), fhuA2 (примерно в 7 раз) и exbB (примерно в 5 раз). В промоторных областях этих трех генов содержатся предполагаемые Fur-боксы. Напротив, экспрессия гена fecD, перед которым Fur-бокс не выявлен, не изменялась существенно у штамма CuFur (менее чем в 2 раза). По-видимому, ген fur вовлечен в регуляцию некоторых генов, кодирующих компоненты предполагаемых систем транспорта сидерофоров в клетки цианобактерий. На основании полученных данных можно заключить, что использованный нами экспериментальный подход с возможностью сверхэкспрессии гена fur в заданных условиях позволяет изучать регуляторные функции этого гена у цианобактерии Synechocystis 6803.
А
Б
Рис. 5. Консенсусная последовательность сайта связывания белка-репрессора Fur (Fur-бокс) в геномах бактерий согласно базе данных RegPrecise (А). Локализация предполагаемых Fur-боксов в кластере генов, кодирующих компоненты предполагаемых систем транспорта сидерофоров у Synechocystis 6803 (Б). Кластер также содержит три регуляторных гена pcrR, pchR1 и pchR2, кодирующих факторы транскрипции семейства AraC (обозначены красным), и 5 открытых рамок считывания с неизвестной функцией (белые). Гены компонентов предполагаемых систем транспорта сидерофоров выделены желтым цветом. Синими стрелками показаны оперонные или моноцистронные транскрипты. Пунктирной стрелкой обозначен предполагаемый оперон fecB2 - sll1203 - sll1204. Информация об оперонной организации генов кластера получена в результате исследований, ранее проведенных в нашей лаборатории.
Таблица 3.
Уровни экспрессии генов fur, fecD, fecE, fhuA2 и exbB у штамма CuFur в сравнении с ДТ
| Штамм Ген | CuFur | ДТ | CuFur/ДТ |
| fur | 0,2000 | 0,0200 | |
| fecD | 0,0012 | 0,0021 | 0,57 |
| fecE | 0,0025 | 0,0300 | 0,08 |
| fhuA2 | 0,0007 | 0,0049 | 0,14 |
| exbB | 0,0014 | 0,0066 | 0,21 |
Уровни экспрессии генов оценивали с помощью ПЦР в реальном времени в клетках, выращенных в среде без меди (условия сверхэкспрессии гена fur у штамма CuFur)
Приведены результаты одного предварительного опыта
Выводы
1. Сконструирован мутант Dfur/CuFur цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, у которого регуляторный ген fur инактивирован инсерцией кассеты устойчивости к спектиномицину в исходном локусе генома, а в нефункциональную часть генома введена интактная копия гена fur под контролем промотора P petJ, активного в отсутствии меди.
2. Сконструирован штамм CuFur, производный штамма дикого типа, у которого тем же способом в нефункциональную часть генома введена интактная копия гена fur под контролем промотора P petJ. У этого штамма выявлена сверхэкспрессия гена fur при росте клеток в среде без меди.
3. При сверхэкспрессии гена fur выявлено существенное снижение экспрессии генов fecE, fhuA2 и exbB, кодирующих компоненты предполагаемых систем транспорта сидерофоров в клетки цианобактерий. Следовательно, можно полагать, что ген fur принимает участие в регуляции этих генов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маниатис Т., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. М.: Мир,, С. 479.
2. Миллер Дж. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, С. 440
3. Gonzalez A.M., Bes T., Barja F., Peleato M.L., Fillat M.F. (2010) Overexpression of FurA in Anabaena sp. PCC 7120. Reveals New Targets for This Regulator Involved in Photosynthesis, Iron Uptake and Cellular Morphology
4. Arnoud H. M. Van Vliet,1† Marie-Lousie A. Baillon, Charles W. Penn, and Julian M. Ketley (1999) Campylobacter jejuni Contains Two Fur Homologs: Characterization of Iron-Responsive Regulation of Peroxide Stress Defense Genes by the PerR Repressor JOURNAL OF BACTERIOLOGY, p. 6371–6376
5. Braun V. and Hantke K. (2007) Acquisition of iron by bacteria. In: Molecular Microbiology of Heavy Metals. D.H Nies., S. Silver (eds). Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg.. P. 189-219.
6. Bsat, N., A. Herbig, L. Casillas-Martinez, P. Setlow, and J. D. Helmann. (1998) Bacillus subtilis contains multiple Fur homologues: identification of the iron uptake (Fur) and peroxide regulon (PerR) repressors. Mol. Microbiol.29:189–198.
7. Bury-Mone, S., J. M. Thiberge, M. Contreras, A. Maitournam, A. Labigne, and H. De Reuse. (2004) Responsiveness to acidity via metal ion regulators mediates virulence in the gastric pathogen Helicobacter pylori. Mol. Microbiol. 53:623–638
8. de Lorenzo, V., S. Wee, M. Herrero, and J. B. Neilands. (1987) Operator sequences of the aerobactin operon of plasmid ColV-K30 binding the ferric uptake regulation (Fur) epressor. J. Bacteriol. 169:2624–2630.
9. Dubrac S., Touati D.(2000) Fur positive regulation of iron superoxide dismutase in Escherichia coli: functional analysis of the sodB promoter. J Bacteriol., 182(13): 3802-3808.
10. Escolar L., Perez-Martin J. and de Lorenzo V. (1999) Opening the iron box: transcriptional metalloregulation by the Fur protein. J. Bacteriol. 181: 6223–6229.
11. Foster, J. W. (1991) Salmonella acid shock proteins are required for the adaptive acid tolerance response. J. Bacteriol. 173:6896–6902.
12. Fox T.C., Guerinot M.L. (1998) Molecular biology of cation transport in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,, 49: 669–696.
13. Fuangthong M., Helmann J. D. (2003) Recognition of DNA by Three Ferric Uptake Regulator (Fur) Homologs in Bacillus subtilis. J. of Bacteriol.,, 185: 6348–6357.
14. Grifantini, R., S. Sebastian, E. Frigimelica, M. Draghi, E. Bartolini, A. Muzzi, R. Rappuoli, G. Grandi, and C. A. Genco. (2003) Identification of iron-activated and -repressed Fur-dependent genes by transcriptome analysis of Neisseria meningitidis group B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:9542–9547.
15. Griggs, D. W., and J. Konisky. (1989) Mechanism for iron-regulated transcription of the Escherichia coli cir gene: metal-dependent binding of Fur protein to the promoters. J. Bacteriol. 171:1048–1054.
16. Hantke, K. (1981) Regulation of ferric iron transport in Escherichia coli:isolation of a constitutive mutant. Mol. Gen. Genet. 182:288–292
17. Hantke K. (2001) Iron and metal regulation in bacteria. Curr. Opin. Microbiol., 4: 172–177.
18. Hernández J.A., Muro-Pastor A.M., Flores E., Bes M.T., PeleatoM.L., Fillat M.F. (2006) Identification of a furA cis antisense RNA in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. J. Mol. Biol. 355:325–334.
19. Holmes D.S. and Quigley M. (1981). A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal. Biochem., 114, 193-197
20. Humphreys G. O., Weston A., Brown M. and Saundecs J. (1978) Plasmid transformation of Escherichia coli. Proceeding of the Fourth European Meeting on Bacterial Transformation and Transfection, Jork, England
21. Bsat N., Helmann J.D. (1999) Interaction of Bacillus subtilis Fur (ferric uptake repressor) with the dhb operator in vitro and in vivo J Bacteriol Jul;181(14):4299-307.
22. Karjalainen, T. K., D. G. Evans, D. J. Evans, Jr., D. Y. Graham, and C. H. Lee. (1991) Iron represses the expression of CFA/I fimbriae of enterotoxigenic E. coli. Microb. Pathog. 11:317–323.
23. KatohH, Hagino N, Grossman AR,Ogawa T (2001) Genes essential to iron transport in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol 183: 2779–2784
24. Kobayashi M., Ishizuka T., Katayama M., Kanehisa M., Bhattacharyya-Pakrasi M., Pakrasi H., Ikeuchi M. (2004) Response to oxidative stress involves a novel peroxiredoxin gene in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol., 45: 290–299.
25. Kunert A, Vinnemeier J, Erdmann N, Hagemann M. (2003) Repression by Fur is not the main mechanism controlling the iron-inducible isiAB operon in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Lett., 227(2): 255-262.
26. Labarre J., Chauvat F. and Thuriaux P. (1989) Insertional mutagenesis by random cloning of antibiotic resistance genes into the genome of the cyanobacterium Synechocystis strain PCC 6803. J. Bacteriol., 171: 3449–3457.
27. Li H., Singh A., McIntyre L., Sherman L.(2004) Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol., 186: 3331–3345.
28. Los D.A. and Sergeyenko, T.V. (2003) Cyanobacterial leader peptides for protein secretion. FEMS Microbiol. Lett. 218: 351-357
29. McHugh J. P., Rodrıguez-Quinones F., Abdul-Tehrani H., Svistunenko D. A., Poole R. K., Cooper C.E., Andrews S.C. (2003) Global Iron-dependent Gene Regulation in Escherichia coli: a new mechanism for iron homeostasis. J. Biol. Chem., 278: 29478–29486.
30. Niederhoffer E.C., Naranjo C.M., Bradley K.L., Fee J.A. (1990) Control of Escherichia coli superoxide dismutase (sodA and sodB) genes by the ferric uptake regulation (fur) locus. J. Bacteriol., 172: 1930-1938.
31. Ochsner, U. A., A. I. Vasil, and M. L. Vasil. (1995) Role of the ferric uptake regulator of Pseudomonas aeruginosa in the regulation of siderophores and exotoxin A expression: purification and activity on iron-regulated promoters. J. Bacteriol. 177:7194–7201.
32. Ouyang Z. and Isaacson R. Identification and Characterization of a Novel ABC Iron Transport System, fit, in Escherichia coli
33. Peter E., Salinas A., Wallner T., Jeske D., Dienst D., Wilde A., Grimm B. (2009) Differential requirement of two homologous proteins encoded by sll1214 and sll1874 for the reaction of Mg protoporphyrin monomethylester oxidative cyclase under aerobic and micro-oxic growth conditions. Biochim. Biophys. Acta 1787:1458–1467.
34. Pospisil P., Arato A., Krieger-Liszkay A., Rutherford A. W. Hydroxyl radical generation by photosystem II. Biochemistry, 2004, 43: 6783–6792.
35. Prince, R. W., C. D. Cox, and M. L. Vasil. (1993) Coordinate regulation of siderophore and exotoxin A production: molecular cloning and sequencing of the Pseudomonas aeruginosa fur gene. J. Bacteriol. 175:2589–2598.
36. Rashid R.A., Tarr P.I., Moseley S.L. (2006) Expression of the Escherichia coli IrgA homolog adhesin is regulated by the ferric uptake regulation protein. Microb. Pathog. 41:207–217.
37. Ratledge C., Dover L.G. (2000) Iron metabolism in pathogenic bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 54:881–941.
38. Rippka R., Deruelles I., Waterbury I., Herdman M. and Stanier. R. (1979). Genetic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol., 111, 1-61.
39. Shcolnick S, Shaked Y., Keren N. (2007) A role for mrgA, a DPS family protein, in the internal transport of Fe in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Biochim. Biophys. Acta 1767:814–819.
40. Sebastian, S., S. Agarwal, J. R. Murphy, and C. A. Genco. (2002) The gonococcal Fur regulon: identification of additional genes involved in major catabolic, recombination, and secretory pathways. J. Bacteriol. 184:3965–3974.
41. Thimm O., Essigmann B., Kloska S., Altmann T., Buckhout T.J. (2001) Response of Arabidopsis to iron deficiency stress as revealed by microarray analysis. Plant Physiol., 127: 1030–1043.
42. Tous C., Vega-Palas M.A., Vioque A. (2001) Conditional expression of RNase P in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 allows detection of precursor RNAs. 276:29059–29066.
43. Vassinova N., Kozyruv D. (2000) A method for direct cloning of Fur-regulated genes: identification of seven new Fur-regulated loci in Escherichia coli. Microbiol. 146, 3171–3182.
44. Visca P., Leoni L., Wilson M. J. and Lamont I. L. (2002) Iron transport and regulation, cell signalling and genomics: lessons from Escherichia coli and Pseudomonas. Mol. Microbiol., 45(5): 1177–1190.
45. Xiong A., Singh V.K., Cabrera G., Jayaswal R.K. (2000) Molecular characterization of the ferric-uptake regulator, Fur, from Staphylococcus aureus. Microbiology 146:659–668.
46. Zhang L., McSpadden B., Pakrasi H.B., Whitmarsh J. (1992) Copper-mediated regulation of cytochrome c553 and plastocyanin in the cyanobacterium Synechocystis 6803. J. Biol. Chem. 267:19054–19059.
47. CyanoBase, http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase
48. Fermentas, http://www.fermentas.com/
49. RegPrecise, http://regprecise.lbl.gov
