Цель:
1. Освоить III этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.
Знать:
1. Цель и последовательность выполнения III этапа бактериологического метода выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
2. Понятие «вид». Критерии вида.
3. Метаболизм микроорганизмов и его особенности.
4. Принцип и методы изучения биохимической активности микроорганизмов.
5. Цель и методы определения антибиотикограмм микроорганизмов в клинической микробиологии.
Уметь:
1. Определить чистоту исследуемой культуры.
2. Посеять исследуемую культуру на «пестрый ряд», среду для определения подвижности.
3. Определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
Контрольные вопросы:
1. Цель и последовательность выполнения III этапа бактериологического метода выделения аэробов.
2. Методы определения чистоты исследуемой культуры.
3. Классификация микроорганизмов по типам питания. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.
4. Ферменты микроорганизмов; их значение в метаболизме клетки. Конститутивные и индуцибельные ферменты.
5. Цель и методы изучения биохимической активности микроорганизмов в микробиологической практике.
6. Прямые и косвенные методы определения подвижности микроорганизмов.
7. Диско-диффузионный метод определения антибиотикограмм: сущность, методика постановки.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести III этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:
- определить чистоту выделенной культуры;
- посеять чистую исследуемую культуру на короткий «пестрый ряд»;
- посеять исследуемую культуру в столбик полужидкого агара;
- определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
2. Ознакомиться с системами для биохимической идентификации бактерий.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Проведение III этапа бак. метода выделения чистых культур аэробов:
1.1. Определение чистоты выделенной культуры.
О чистоте культуры свидетельствует однородность роста и наличие в препарате микроорганизмов одного вида. Поэтому при макроскопическом исследовании роста, отмечая его интенсивность (скудный, умеренный, обильный), прозрачность, цвет обратите внимание на его однородность. Приготовьте фиксированный препарат, коснувшись петлей нижней, средней и верхней части косяка, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Полученные результаты внесите в протокол и сделайте вывод. В том случае, если выделенная Вами культура чистая, приступайте к дальнейшему ее исследованию.
1.2. Посев культуры на «пестрый ряд».
Проведите посев чистой исследуемой культуры на «пестрый ряд»: полужидкие среды Гисса с индикатором ВР, углеводами (глюкоза, лактоза, маннит) и МПБ.
Пересев в полужидкие среды осуществляется бактериологической иглой или бак. петлей диаметром 1 мм уколом в толщу агара, не доходя до дна пробирки»1 мм. При пересеве в жидкие среды петлю с биомассой исследуемой культуры погружают в жидкость, растирают на стенке пробирки и смывают. После этого между стенкой пробирки и пробкой помещают индикаторные бумажки для определения индола и сероводорода (H2S), не допуская смачивания краев пробирки и пробки питательной средой!
Основой изучения биохимических свойств микроорганизмов с целью их идентификации является определение промежуточных и (или) конечных продуктов метаболизма. Таксономическое значение имеют сахаролитические и протеолитические свойства бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах, входящих в состав «пестрого ряда».
Определение сахаролитических свойств производится на средах Гисса. Их состав: пептонная вода, 1% углевода, индикатор Андреде (ВР или др.), 0,3-0,5% агара, если среда полужидкая; если среда жидкая, то в пробирки опускают поплавки (короткие стеклянные трубочки, запаянные с одного конца).
Критерии учета результатов:
· цвет среды не меняется - культура не ферментирует углевод;
· цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде – со светло-желтого на красный, ВР – с розового на синий и т. д.) – культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот);
· цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке - культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов.
Определения протеолитических свойств производится на пептонной воде (ПВ) или мясо-пептонном бульоне (МПБ) с учетом образования конечных продуктов метаболизма белков (пептона, аминокислот) – индола, H2S, а в ряде случаев аммиака.
Образование индола сопровождается окрашиванием в розовый цвет индикаторной бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (метод Мореля); образование сероводорода – почернение индикаторной бумажки, пропитанной ацетатом свинца; образование аммиака – посинением лакмусовой бумажки.
МПБ и ПВ предназначены также для изучения характера роста микроорганизмов в жидкой питательной среде. Рост микробов может быть в виде диффузного помутнения, придонного осадка, пленки на поверхности среды.
1.3. Посев исследуемой культуры в столбик полужидкого агара.
Произведите посев исследуемой культуры в столбик полужидкого агара уколом с помощью бак. иглы или бак. петли диаметром 1 мм.
Посев культуры в столбик полужидкого агара позволяет определить ее отношение к молекулярному кислороду, а значит и косвенно составить представление о способе получения энергии. Критерием учета и оценки является характер роста: рост только сверху среды – культура является аэробом, только в нижней чсти среды – анаэробом; сверху и по уколу – факультативным анаэробом; рост на некотором расстоянии от поверхности среды – микроаэрофиллом.
При этом способе посева у факультативно-анаэробных микроорганизмов можно определить подвижность. Рост строго по уколу – культура неподвижна, рост диффузный – подвижна.
1.4. Определение антибиотикограммы исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
Этиотропную антимикробную химиотерапию клиницисты проводят с учетом результатов бак. метода, который наряду с выделением возбудителя из клинического материала и его идентификацией включает определение чувствительности к антимикробным химиопрепаратам. Для определения чувствительности в России чаще всего используют диско-диффузионный метод (ДДМ).
Для определения антибиотикограммы приготовьте взвесь исследуемой культуры в стерильном физиологическом растворе и доведите до мутности 0,5 по МакФарланду (1,5 х 108 КОЕ/мл). Для посева используйте стерильный ватный тампон, который погрузите в пробирку с суспензией, ротируйте его, чтобы он равномерно пропитался, а затем тщательно отожмите о сухую стенку пробирки выше уровня жидкости путем покручивания. Посев культуры на чашку со средой АГВ проведите штрихами в трех направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси. В заключение сделайте несколько вращательных движений тампоном по краям агаровой поверхности. После этого посевам дайте возможность подсохнуть в течение нескольких минут при комнатной t° в чашках с закрытыми крышками. Диски с антибиотиками нанесите не позднее 15 мин после инокуляции стерильным пинцетом или с помощью автоматического диспенсора. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм помещают не более 6 дисков. Каждый диск следует аккуратно прижать пинцетом, чтобы обеспечить его контакт с питательной средой. Чашки непосредственно после наложения дисков подпишите и поместите вверх дном в термостат при 37° на 18-20 ч.
Учет и оценка результатов. Для измерения диаметра зон задержки роста чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал под углом 45°. Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм с помощью линейки или штангенциркуля. Интерпретация результатов ведется по табличным данным предприятия-изготовителя дисков.
