Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата.

Лекция №6

Основы ферментативного катализа.

Краткая история изучения кинетики ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата. Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен. Ферментативная активность. Каталитическая константа - число оборотов фермента. Максимальная скорость ферментативной реакции (V_max). Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (K_s). Константа Михаэлиса-Ментен (K_m).

Краткая история изучения кинетики ферментативных реакций.

Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям.

Самая ранняя попытка математически описать ферментативные реакции была предпринята Дюкло в 1898 г. Браун (1902) и независимо от него Анри (1903) впервые выдвинули гипотезу об образовании в ходе реакции фермент-субстратного комплекса. Это предположение основывалось на трех экспериментальных фактах:

1. папаин образовывает нерастворимое соединение с фибрином (Вюрц, 1880);

2. сахароза защищает фермент инвертазы от тепловой денатурации (О`Салливан и Томпсон, 1890);

3. Фишер в 1898-1899 показал, что ферменты являются стереохимически специфическими катализаторами.

В 1913 году Михаэлис и Ментен опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций. Их уравнение стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов вот уже почти целый век.

МИХАЭЛИС (Michaelis), Леонор

16 января 1875 г. – 8 октября 1949 г.

Леонор Михаэлис – немецкий биохимик и химик-органик, основатель кинетики ферментативных процессов. Основные работы посвящены изучению ферментативных реакций. В 1913 г. ввёл константу (константа Михаэлиса) в уравнение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в стационарном состоянии (уравнение Михаэлиса – Ментен).

 

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата.

Предварительные эксперименты по изучению кинетики ферментативных реакций показали, что скорость реакции E + S E + P, вопреки теоретическим ожиданиям, не зависит от концентрации фермента и субстрата так, как в случае обычной реакции второго порядка.

В тоже время к ферментам применимы три основных критерия, характерных и для неорганических катализаторов, а именно:

1. Они остаются неизмененными после реакции, т.е. освобождаясь, могут вновь реагировать с новыми молекулами субстрата (хотя нельзя исключить побочных влияний условий среды на активность фермента).

2. Ферменты способны оказывать действие в ничтожно малых концентрациях (например, одна молекула фермента ренина, содержащегося в слизистой оболочке желудка теленка, створаживает около 10⁶ молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре 37°С). Наличие либо отсутствие фермента или любого другого катализатора не оказывает влияния на величину константы равновесия и свободной энергии (ΔG).

3. Катализаторы лишь повышают скорость, с которой система приближается к термодинамическому равновесию, не сдвигая точки равновесия.

На активность фермента оказывают влияние все те факторы, которые могут вызвать изменение его структуры, а именно, к числу таких факторов относятся:

1. рН

2. Т

3. Силы, действующие в текучих средах (гидродинамические силы, гидростатическое давление и поверхностное натяжение)

4. Химические агенты (спирт, мочевина или пероксид водорода и др.)

5. Облучение (свет, звук, ионизирующая радиация)

6. Различные химические соединения, которые связываясь с ферментами, могут изменять скорость катализируемых ферментами реакций.

Иногда снижение каталитической активности, вызванное, например изменением рН, обратимо. В таких случаях возврат к первоначальным условиям сопровождается восстановлением активности фермента. Возможно и необратимое изменение активности фермента.

Рассмотрим влияние различных факторов на скорость ферментативной реакции.

Влияние температуры

Одним из основных уравнений химической кинетики является уравнение Аррениуса, выражающее зависимость константы скорости реакции от температуры:

Однако, температурный диапазон ферментативных реакций, для которого применимо уравнение Аррениуса, очень узок для большинства ферментов. Что же произойдет, если мы попытаемся заставить фермент катализировать процесс еще быстрее, подняв температуру выше физиологически допустимой? При высокой температуре, когда начинает доминировать процесс термической инактивации фермента, нарушается зависимость скорости реакции от температуры, описываемая уравнением Аррениуса – а именно, после определенного температурного максимума скорость реакции быстро падает дот нуля. С другой стороны при снижении температуры ниже 0°С скорость реакции также падает до нуля, т.е. реакция полностью прекращается. Таким образом ферментативные реакции имеют колоколообразную зависимость скорости реакции от температуры, что объясняется наложением двух эффектов - возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при высоких температурах. Денатурация большинства белков начинается в диапазоне температур от 45 до 50°С и завершается очень быстро при 55°С. Прекращение ферментативных реакции при низких температурах обусловлено тем, что водные растворы замерзают.

Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. При температуре 90°С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляет только два фермента – миокиназа, которая выдерживает нагревание до 100°С, ДНК-полимераза из термофильных бактерий макс. при 90°С). Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура 40-45°С; в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (4°С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Это явление обусловлено изменением строения активного центра фермента вследствие уменьшения плотности воды. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. В настоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказано существование прямой зависимости между скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка. Таким образом, влияние температуры на скорость ферментативной реакции подчиняется уравнению Аррениуса лишь в сравнитель узком диапазоне температур 4-45°С. Вне этого диапазана скорости ферментативных реакций резко снижаются, что учитывается и используется в пищевых технологиях и при хранении пищевых продуктов и лекарственных средств, содержащих ферменты. Привести примеры.

Влияние рН среды.

Ферменты, как и все белки, состоят из аминокислот. В зависимости от рН радикалы некоторых аминокислот, а значит, и белок в целом могут приобретать заряд. Заряженные группы часто входят в состав активных центров ферментов, так как в основе целого ряда механизмов ферментативного катализа лежит катализ кислотного или основного типа. Необходимым условием для осуществления кислотного или основного катализа может быть наличие определенного заряда на ионизируемых группах активного центра. Отсюда следует, что каталитически активная форма фермента существует только в одном строго определенном состоянии ионизации, и в зависимости от рН в нее может превращаться большая или меньшая часть всего имеющегося в смеси фермента.

Зависимость активности фермента от рН имеет колоколообразную форму с довольно узким максимумом. Для разных ферментов значение рН, при котором фермент имеет максимальную активность различно. В эксперименте достаточно часто используется исследование рН-зависимостей ферментативных реакций для изучения числа и свойств ионогенных групп.

При определении зависимости активности фермента от концентрации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях рН среды, обычно при оптимальной температуре и наличии достаточно высоких (насыщающих) концентраций субстрата. На рисунке и в таблице приводятся оптимальные значения рН среды для ряда ферментов.

Рис. Зависимость активности ферментов от рН.

 

 

Из данных табл. 4.3 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляют пепсин, рН-оптимум которого 2,0 (при рН 6,0 он не активен и не стабилен). Объясняется это, во-первых, структурной организацией молекулы фермента и, во-вторых, тем, что пепсин является компонентом желудочного сока, содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента. С другой стороны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильнощелочной зоне (около 10,0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды.

Согласно современным представлениям, влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина, NH₂-группы лизина и др.). При резких сдвигах от оптимума рН среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Имеет значение, кроме того, состояние ионизации субстратов и кофакторов.