Фрагментов
Рестриктазы расщепляют ДНК в специфичес-ких участках, обычно в палиндромных последователь-ностях. Когда одно из оснований в такой последо-вательности изменяется в результате мутации, этот участок перестает расщепляться рестриктазами. В то же время мутации могут приводить к образованию новых участков, чувствительных к рестриктазе. В результате соответствующие фрагменты ДНК, полученной от двух генетически не идентичных индивидов, образуют рестрикционные фрагменты различной длины. Это явление носит название полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК
На рисунке приведен метод выявления ПДРФ.
Прежде всего, ДНК-фрагмент, содержащий исследуемую последовательность, амплифицируютс помощью ПЦР. Затем амплифицированный фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой.Фрагменты разделяют гель-электрофорезом, интересующий фрагмент выявляют с помощью специфичного генного зонда. На рисунке приведены результаты применения метода в криминалистике. Рестрикционная карта образца ДНК, выделенной из ткани, найденной на месте преступления, четко совпадает с пробой, взятой у подозреваемого 2, а не у подозреваемого 1. для получения такого «генетического отпечатка» достаточно очень малого количества материала, содержащего ДНК. Вторым важным практическим приложением ПДРФ-анализа является выявление генетических мутаций, ведущих к наследственным заболеваниям.
Секвенирование ДНК
Современным методом определения нуклеотидной последовательности ДНК секвинирования ДНК является метод обрыва цепи. Прежде всего ДНК клонируют в фаге М1З, из которого легко выделяют однонитевую ДНК (а). Ее гибридизуют с короткой ДНК, называемой праймером, которая связывается с 3′ концом однонитевой ДНК (б). Затем к полученной матрице добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата(d-НТФ), а именно, d-АТФ, d-ГТФ, d-ТТФ и d-ЦТФ. Кроме дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в реационную смесь добавляют один из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов(dd-НТФ). Затем с помощью ДНК-полимеразыведут синтез второй (комплементарной ДНК). Остановка синтеза (обрыв цепи будет происходить всякий раз, когда вместо d-НТФ в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему dd-НТФ. На схеме 3 принцип метода демонстрируется на примере с dd-ГТФ. В этом случае образуются фрагменты, которые включают праймер плюс 3, 6, 8, 13 или 14 других нуклеотидов Для определения последовательности нуклеотидов необходимо поставить 4 отдельные реакции в присутствии каждого из 4-х dd-НТФ (в). Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез (г). Длинапробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи. Как только фрагменты ДНК визуализированы (д), нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствие с очередностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных дорожках геля. Реальная электрофореграмма с четырьмя дорожками приведена на схеме 2, рис.2. При оптимальных условиях с помощью метода обрыва цепиможно в одном эксперименте определить строение фрагмента, включающего 100-120 нуклеотидов.
Зная последовательность нуклеозидов в гене, соответствующий данному гену белок, а также генетический код легко усьтанавливается первичная структура белка, т.е. последовательность аминокислот в полепептидной цепи.
Аминокислоты кодируются триплетами нуклеозидов, например,
триплет ЦТТ кодирует аминокислоту фенилаланин,
ЦАТ – тирозин
ТЦЦ – аланин и т.д.
