Полимеразная цепная реакция и амплификация фрагментов ДНК.

Методы генной инженерии

Взаимосвязь генной инженерии и биохимии и основные этапы ее развития. Методы генной инженерии. Эндонуклеазы рестрикции. Клонирование ДНК. Полимеразная цепная реакция и амплификация фрагментов ДНК. Анализ длины рестрикционных фрагментов. Секвенирование ДНК

1. Взаимосвязь генной инженерии и биохимии и основные этапы ее развития. Развитие генной инженерии начавшееся с 70-х годов прошлого века в значительной степени основано на разработке и совершенствовании биохимических методов анализа и манипулирования ДНК. Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, которая использует методы таких наук, как биохимия, молекулярная биология, генетика и микробиология. Биотехнология как отдельная дисциплина выросла из биохимии в середине прошлого века. Биотехнология это совокупность методов получения различных продуктов: пищевых продуктов, лекарственных средств, витаминов и др. с использованием микроорганизмов. По мере развития биохимических и микробиологических методов исследования микроорганизмов сформировалась молекулярная биология в середине 60-х годов прошлого века и затем на базе молекулярной биологии возникла генная инженерия Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых и овощных культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство витамина В₁₂ путем выращивания бактерий на парафинах (процесс «Пайрекс»), производство кортизона, где стадия окисления в положение 11 стероидного цикла осуществляется микробиологическим путем, утилизация и очистка сточных вод, выведение новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Во второй половине XX века было сделано несколько важных открытий и изобретений, лежащих в основе генной инженерии. Успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была начатабиохимиками учёным Ф. Сенгером* и американским учёным У. Гилбертом**. Как теперь известно, в генах содержится информация для синтеза в организме молекул РНК и белков, в том числе ферментов.

—

* Фредерик Сенгер – английский биохимик. Основные работы посвящены химии белка. Разработал

методы получения инсулина и др. гормонов. Предложил метод секвенирования

ДНК. Нобелевские премии 1958 и 1980 годов.

* Уолтер Гилберт – американский биохимик. Основные работы посвящены молекулярной биологии.

Предложил метод секвенирования стуктуры ДНК. Установил первичную структуру

ряда ДНК. Нобелевская премия 1980 г совместно с Ф.Сенгером.

Чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов.

А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые, ранее отсутствовавшие гены. Изменения генов в живых клетках - это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов - химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контролировать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку.

Генная инженерия человека

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат, выращенный из модифицированной яйцеклетки.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

 

Методы генной инженерии.

Эндонуклеазы рестрикции

Большинство методик в генной инженерии включают выделение определенных фрагментов ДНК и последующее их соединение с другими фрагментами для получения новых комбинаций генов. Для этих целей используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь сшивают молекулы ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), катализирующие специфическое расщепление двунитевой ДНК, за открытие которых и разработку методов использования их в молекулярной генетике биохимики Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии в1978 г.

Известно большое число рестриктаз. для их обозначения используются сокращенные названия микроорганизмов-продуцентов. В качестве примера рассмотрим ЕсоRi эндонуклеазу, выделенную из Еsсhегiсhiа соli.

Подобно многим другим рестриктазам, этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной последовательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при считывании в направлении 5’→З’ имеют одинаковую последовательность. для Есоli это последовательность 5’-ГААТТЦ-З’. ЕсоRiрасщепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между Г и А.

 

Это приводит к образованию комплементарных «липких » концов (ААТТ), которые удерживаются вместе за счет водородных связей между комплиментарными основаниями. Их, однако, можно легко отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении липкие концы гибридизуются (т.е. соединяются как раньше за счет водородных связей) вновь в правильной ориентации. Места расщепления можно соединить с помощью ДНК-лигазы.

 

Клонирование ДНК

Обычно содержание в клетке какого-либо сегмента ДНК, например отдельного гена очень незначительно. Поэтому для проведения экспериментов с фрагментами ДНК их необходимо многократно копировать (клонировать). В классической методике клонирования ДНК используется способность клеток бактерий поглощать и реплицировать (репликация – катализируемый ферментами процесс удвоения ДНК) короткие кольцевые молекулы ДНК, известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается из исходной ДНКс помощью одной или двух рестриктаз. Вырезанный с помощью рестриктаз ген встраивают в плазмиду, которая называется вектором. В качестве вектораслужит плазмида с единственным участком, узнаваемым ЕсоRi.

Кольцевая плазмида линеаризуется с помощью ЕсоRi и затем смешивается с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрирован в структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшиваются с помощью ДНК-лигазы с образованим «рекомбинантной»плазмиды.

 

При обработке большого количества клеток некоторые из них поглощают рекомбинантную плазмиду(так называемая трансформация). Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собственным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформированной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибиотику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полученного клона выделяют плазмиду и после расщепления рестриктазой ЕсоRi, получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.

 

Полимеразная цепная реакция и амплификация фрагментов ДНК.

При нагревании ДНК до 90˚С двухнитевая молекула расплетается иобразуются однонитевые молекулы ДНК. Если в растворе при этом находятся в достаточном количестве все 4 нуклеозида (А, T, Г, Ц), то при охлаждении смеси на каждой однонитевой молекуле ДНК будут коплиментарно пристаиваться отдельные нуклеозиды (А всегда с, Г всегда с Ц), которые удерживаются на однонитевой молекуле за счет водородных связей, но между собой ковалентно не связаны. Сшивка отдельных нуклеозидов в полноценную молекулу ДНК осуществляется под действие термостабильного фермента – ДНК полимеразы, выделенной из термостабильных бактерий, живущих при температурах до 110̊С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет многократно воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент ДНК без помощи рестриктаз, векторов или клетки-хозяина. Для этого нужно иметь в своем распоряжении два олигонуклеотида (праймера), каждый из которых будет гибридизоваться с одной из цепей на противоположных концах подлежащего амплификации фрагмента ДНК, достаточное количество дезоксирибонуклеозид-трифосфатов и специальную термостабильную ДНК-полимеразу. Праймер синтезируют, а полимеразу получают из термостабильных бактерий

На первой стадии двунитевую ДНК нагревают до 90°С для разделения цепей и получения однонитевой ДНК (а). Затем смесь охлаждают, чтобы произошла гибридизация с праймерами (б). Комплементарные цепи ДНК синтезируются в обоих направлениях, начиная от праймеров (в). Этот циклическийпроцесс (цикл 1) повторяют с той же самой реакционной смесью (цикл 2,З и тд.) 20-30 - кратно. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Их количество удваивается после каждого цикла до тех пор, пока почти все синтезированные фрагменты не будут соответствовать первоначальному фрагменту, ограниченному праймерами. Циклы нагревания и охлаждения проводятся в термостате -амплификаторе с программируемым температурным режимом.

Амплификация фрагмента ДНК