При нокауте МАLAT к-во paraspeckles уменьшается
Однако некоторые ядерные структуры самоорганизуются из белков без участия некодирующих РНК.
МРНК в дифференцированной клетке может задерживаться в ядре. Желтые нити, из которых состоит шарик – NEAT РНК. Параспеклов нет в эмбриональных стволовых клетках, мРНК не удерживается в ядре, транслируется в цитоплазме. Полученные белки препятствуют дифференцировке клеток и обеспечивают плюрипотентность.
И последнее о роли нкРНК в регуляции ядерно-цитоплазматических отношений.
Некодирующая РНК NRON – n on coding r epressor o f N FAT (N FAT – транскрипционный фактор NF of activated Т cells, попадает в ядро по сигналу – фосфорилированию). Мишень NFAT – ген теломеразы. ncNRON препятствует входу в ядро (с участием импортина) транскр.фактора NFAT, каким образом – не сказал(((.
Итог о роли РНК в регуляции транскрипционной генетической программы
• Связывание с факторами транскрипции, аллостерические эффекты за счет изменения конформации белка
• Реализация гормональных эффектов - нкРНК, определяющая функционирование стероидных гормонов.
• Enhancers nc eRNAs – благодаря тому, что энхансеры транскрибируются, они узнают свою мишень, без транскрипции, возможно, они не узнают ее
• Регуляция элонгации транскрипции (7SK)
• Регуляция процессинга РНК и сплайсинга – спеклы и параспеклы
• Транспорт из ядра в цитоплазму
• Структурная роль в сохранении транскрипта в ядре
Короткие 20-35 н регуляторные РНК
1.siРНК, small interfering (RNA interference)
2. микро РНК
3. piРНК, связываемые белками cемейства Piwi (самый обильный класс коротких РНК).
РНК-интерференция РНКи
Исследования начались в начале 20 века. 2006 год – Нобелевская премия.
В широком смысле – способ регуляции экспрессии генов (чаще сайленсинг) с участием короткой РНК (30-20 нуклеотидов) (хотя недавно открытые piРНК больше 30 нт) и эффекторных белков (Аргонавт), участвующих в узнавании комплементарных последовательностей в составе комплекса «короткая РНК - РНК-мишень», а возможно и РНК-ДНК.
РНК-интерференция участвует в подавлении трансляции, обеспечивает образование гетерохроматина, участвует в перестройке генома.
Была обнаружена в 1998 году. Изучали экспрессию генов у C.elegans, пытались подавить экспрессию генов путем введения antisense РНК (до этого были высказаны теоретические предпосылки). Однако самый лучший эффект (подавление мишени) был достигнут при введении двунитевой РНК. Вывод – контроли – очень важная часть эксперимента. Подавление мишени специфично!
У дрозофилы биохимически обнаружили Dicer – эндонуклеазу (РНКаза III типа), осуществляющую расщепление dsРНК на кусочки siРНК длиной 20-30 нуклеотидов с 3’OH – выступающими динуклеотидными концами. Это этап инициации функционирования РНК-интерференции.
Далее кусочки входят в состав комплекса белков RISC (RNA Induced Silencing Complex), главный из которых белок Аргонавт. Argonaute выбирает одну из нитей, для узнавания мишени. Белки-аргонавты могут обладать эндонуклеазной активностью или просто взаимодействовать и подавлять транскрипцию.
В 1998 году была открыта интерференция с помощью экзогенной siРНК, теперь известно, что в клетке есть эндогенная siРНК, принимающая участие в регуляции экспрессии генов.
Откуда название «аргонавт»?
1998 год – опубликована работа на арабидопсисе. Выявлен ген, отвечающий за дифференцировку клеток меристемы. Фенотип мутанта: нарушается дифференцировка листьев. Листья напоминают щупальца моллюсков семейства Аргонавт.
У нематоды этих белков особенно много, они выполняют разнообразные функции.
Белки очень консервативны. У человека их 4.
РНКи как метод исследования
- способ выяснения функции нкРНК
- терапевтический агент (сложна проблема доставки siРНК в нужные органы, хотя сначала был бум исследований)
Современный способ исследования Knock down (в отличие от knockout) – способ сильно снизить образование белка с целью выяснения его биологической функции можно осуществлять с помощью РНКи. Особенно хорошо действует для уничтожения РНК в цитоплазме, в ядре очень плохо, либо вообще не идет.
Эндогенные siРНК осуществляют защиту генома от транспозонов и вирусов, регуляция экспрессии собственного генома. А экзогенные участвуют в борьбе против инфекционных агентов.
Дайсер – эндонуклеаза, относится к семейству РНКаз III, осуществляющих процессинг рРНК.
Красные и синие – отрицательно и положительно заряженные аминокислотные участки соответственно. Имеет 2 эндонуклеазных домена, которые в составе молекулы димеризуются. 3’-конец дцРНК узнается одним доменом (возможно, PAZ), дальше он кладет РНК на свое тело (жуткая словарная конструкция). После первого разрезания Dicer отмеряет от 3’OH-конца определенное расстояние и вносит разрыв – поэтому молекулярная линейка. Фосфаты участвуют в электростатических взаимодействиях с + аминокислотами.
Дайсер никогда не работает один, имеет возле себя биохимическую нишу – дополнительные белки-партнеры.
У человека, нематоды, млекопитающих один Дайсер. У растений их несколько, у дрозофилы два. И Дайсер, и его партнер имеют RNA-binding domain, узнающий дцРНК. Участвуют в узнавании концов. А-У слева термодинамически менее устойчива, чем Г-Ц справа, поэтому только нижняя красная нить попадает в зрелый комплекс, становится РНК-гидом, так как у нее менее стабильный 5’-конец. Если стабильность одинаковая, происходит случайное включение.
| 
|
Белки Аргонавт имеют сходную структуру у разных организмов.
Белок Аргонавт тоже имеет PAZ-домен, которые узнает 3’OH-конец РНК-гида, 5’-конец узнается другим доменом и вступает в стэкинг-взаимодействие с ароматической АК (например, с Tyr) → зрелый комплекс.
4 домена NTD, PAZ, PIWI-домен, обладающий эндонуклеазной активностью, MID – средний.
2 доли, между ними активный центр. Каталитический сайт представлен Asp, Asp, Asp/Glu (каталитическая триада) + 2 Mg2+, хотя не всегда Аргонавт с триадой будет работать как эндонуклеаза. Каталитический центр похож на каталитический центр РНКазы Н. У человека 4 Аргонавта, все имеют триаду, но только один активен – очевидно, каталитическую активность определяют еще конформационные переходы.
Картинка – PAZ в Дайсере и Аргонавте
Аргонавты были исследованы даже у термофилов-прокариот, их белки имеют меньшую подвижность – удобно проводить РСА. Что тут делает Аргонавт – неизвестно, т.к. у бактерий нет системы siРНК. У бактерий Аргонавты гораздо лучше связывают ДНК, чем РНК.
Выяснилось, что AGO могут выполнять и функции, которые не связаны с узнаванием РНК. Оказалось, что один из Аргонавтов участвует в образовании инсуляторного комплекса.
