ЗАНЯТИЕ 23
Тема: Микробиологическая диагностика сифилиса.
Микробиологическая диагностика хламидийных и микоплазменных инфекций.
Цель: На основе знаний биологии возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.
Знать:
1. Классификацию и морфобиологические особенности возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.
2. Экологию, особенности патогенеза и иммунитета при сифилисе и заболеваниях, вызываемых хламидиями и микоплазмами.
3. Материал и методы микробиологической диагностики сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.
4. Неспецифическую профилактику и этиотропную терапию сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.
Уметь:
1. Учитывать и оценивать результаты реакции микропреципитации, РНГА при серологической диагностике сифилиса.
2. Учитывать и оценивать результаты непрямой РИФ с материалом от обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз.
3. Учитывать и оценивать результаты ИФА с сывороткой обследуемого и хламидийным антигеном.
4. Учитывать и оценивать результаты биохимического теста с материалом обследуемого с подозрением на урогенитальный микоплазмоз.
5. Учитывать и оценивать чувствительность возбудителя урогенитального микоплазмоза к антибиотикам.
Контрольные вопросы:
1. Систематическое положение возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.
2. Морфобиологическая характеристика возбудителей сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.
3. Экология, эпидемиология, особенности патогенеза и иммунитета при сифилисе, хламидийных и микоплазменных инфекциях.
4. Материалы и методы микробиологической диагностики сифилиса и заболеваний, вызываемых хламидиями, микоплазмами.
5. Неспецифическая профилактика и этиотропная терапия сифилиса, хламидийных и микоплазменных инфекций.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести серодиагностику сифилиса, для чего:
1.1. Поставить, учесть и оценить результаты реакции микропреципитации с инактивированными сыворотками обследуемых (С1, С2, СЗ, С4, С5).
1.2. Учесть и оценить результаты РПГА с сыворотками обследуемых, у которых реакция микропреципитации была положительна.
На основании полученных результатов сформулировать вывод.
2. Провести микробиологическую диагностику урогенитального хламидиоза, для чего:
2.1. Учесть и оценить ИФА с сывороткой обследуемого на урогенитальный хламидиоз и хламидийным антигеном C. trachomatis.
2.2. Учесть и оценить РИФ непрямую с материалом от обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз.
3. Провести исследование соскоба из цервикального канала от обследуемой с бесплодием с помощью тест-системы Mycoplasma DUO, для чего:
3.1. Выявить наличие микоплазм и определить их количество.
3.2. Определить чувствительность культуры к антибиотикам.
На основании полученных результатов сформулировать вывод; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
4. Описать биопрепараты: антиген для реакции Вассермана, кардиолипидный антиген для реакции микропреципитации.
Методические указания, выполняемые в ходе УИРС:
I. Проведите серологическое исследование по обнаружению антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови обследуемых, для чего:
1.1. Поставьте, учтите и оцените результаты реакции микропреципитации с инактивированными сыворотками крови обследуемых (С1, С2, СЗ, С4, С5).
Техника постановки реакции микропреципитации (МПР): пастеровской пипеткой набирают инактивированную сыворотку крови каждого обследуемого и вносят по 3 капли в лунки планшета, куда затем добавляют по 1-й капле кардиолипинового антигена. Ингредиенты смешивают встряхиванием планшета в течение 5-ти минут, добавляют 3 капли физ. раствора, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28°С). Одновременно ставят контроли сывороток: КС"+"- сыворотка, заведомо содержащая антитела к возбудителю сифилиса, КС"-"-сыворотка, заведомо не содержащая антитела к возбудителю сифилиса.
Учет: результат учитывают визуально по появлению хлопьев в лунках, что является свидетельством положительной реакции.
Критерии достоверности: положительная МПР с контрольной сывороткой КС"+" и отрицательная реакция - с контрольной сывороткой КС"-".
Оценка: положительная реакция микропреципитации свидетельствует о возможном наличии антител в сыворотке обследуемых и выявлении заболевания сифилисом. Отрицательный результат свидетельствует о серологическом не подтверждении заболевания.
В настоящее время при серодиагностике сифилиса рекомендовано использовать в качестве скрининговых (отборочных) методов МПР с кардиолипиновым антигеном, РСК с кардиолипиновым антигеном – реакцию Вассермана (приказ №87 от 26.03.2001 МЗ РФ «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»). Поскольку МПР технически более простая, требует меньше времени на постановку, то при микробиологической диагностике она используется чаще.
1.2. Учтите и оцените результаты РПГА с сыворотками обследуемых, у которых МПР была положительна (см. занятие № 10).
МПР и РСК не являются специфическими и в ряде случаев дают ложноположительный результат. Для распознавания ложноположительных результатов и подтверждения результатов отборочных реакций используют специфические, чувствительные реакции. К их числу относятся РПГА, ИФА, РИТ (реакция иммобилизации трепонем), РИФн. Недостатками РИТ и РИФн является техническая сложность, длительность постановки, высокая стоимость исследования; кроме того, приблизительно у 85% адекватно пролеченных больных эти реакции остаются положительными в течение нескольких лет и даже в течение всей жизни, поэтому не могут быть использованы в качестве контроля излеченности.
II. Проведите микробиологическую диагностику урогенитального хламидиоза, для чего:
2.1. Учтите и оцените ИФА с сывороткой обследуемого на урогенитальный хламидиоз и хламидийным антигеном C. trachomatis (см. занятие №11).
2.2.Учтите и оцените непрямую РИФ с материалом от обследуемого с подозрением на урогенитальный хламидиоз (см. занятие №11).
Результат РИФн считается положительным, если в мазке выявляют ярко-зеленые светящиеся мелкие, круглые (элементарные тельца хламидий) или овальные (ретикулярные тельца хламидий) частицы. Тельца располагаются отдельно, на поверхности эпителиальных клеток или внутриклеточно. Эпителиальные клетки окрашены в красно-оранжевый цвет.
Результат считается отрицательным, если в мазке отсутствует специфическое свечение при обязательном наличии не менее 50 эпителиальных клеток.
III. Проведите исследование соскоба из цервикального канала от обследуемой с бесплодием с помощью тест-системы Mуcoplasma DUO, для чего:
3.1. Выявите наличие возбудителя и определите его количество.
Набор Mуcoplasma DUO позволяет культивировать, идентифицировать и дифференциально титровать урогенитальные микоплазмы, а также определять чувствительность культуры к антибиотикам. Метод позволяет получить результаты в течение 24-48 ч.
Материалом для исследования являются соскобы из уретры, цервикального канала, влагалища (реже – из глотки, назофарингиальной зоны, конъюнктивы у детей). Так как микоплазмы прилипают к поверхности эпителиальных клеток, следует хорошо поскоблить слизистую. Затем тампончик (предпочтительно специальный цитологический тампончик Bactopick) погружается в 2 мл транспортной среды и взбалтывается, чтобы смыть все клетки в среду.
Идентификация и титрование урогенитальных микоплазм основаны на специфических метаболических свойствах каждого микроорганизма, которые гидролизуют:
- Ureaplasma urealiticum (UU) – мочевину;
- Mycoplasma hominis (MH) – аргинин.
При этом образуется ион аммония и происходит защелачивание среды. Вследствие этого изменяется цвет (с желтого на красный) индикатора кислотности среды, что позволяет визуализировать реакцию. Таким образом, при желтой окраске содержимого лунок – микоплазмы отсутствуют, при красной окраске – микоплазмы присутствуют в пробе. Если покраснела лунка U – в пробе присутствует UU; если покраснела лунка Н – в пробе присутствует МН; если покраснели лунки U и Н – в пробе присутствуют и UU, и МН.
Т и т р о в а н и е (определение количества) основано на принципе разведения исследуемого материала в жидкой среде. Проба последовательно разводится в транспортной среде, в лунке D (разведение 10-1) и, наконец, в лунках U > 104 и Н > 104 (разведение 10-2). Таким образом, может быть определен титр микоплазм. Этот титр соответствует лунке, цвет которой изменился на красный через 24-48 ч инкубации.
Данный набор позволяет определить титры порядка 10-3 – 10-4 мл, которые уже считаются этиологически значимыми.
Учет результатов: первые результаты считываются через 24 ч инкубации. При наличии положительной реакции в лунке с высоким титром (104), получают окончательный результат. Второй раз считывают результаты через 48 ч в следующих случаях:
- если нужно подтвердить отрицательный результат,
- определить присутствие микоплазм в низких титрах,
- определить штаммы, присутствующие в высоком титре, но характеризующиеся медленным метаболизмом.
3.2. Определите чувствительность культуры к антибиотикам.
Микроплата для определения чувствительности к антибиотикам включает два ряда по 8 лунок, содержащих различные антибиотики. Разные концентрации антибиотиков в лунках позволяют получить профиль чувствительности тестируемых микоплазм (чувствительная, умеренно устойчивая, устойчивая). Лунки Тс служат контролем роста без антибиотиков. Определение осуществляется с использованием содержимого лунки Х набора Mуcoplasma DUO.
Оценка-интерпретация. Тест интерпретируется тогда, когда контрольные лунки роста изменят цвет с желтого на красный. На практике плата исследуется через 24 ч и через 48 ч для установления низкой резистентности:
- 2 желтых лунки – отсутствие роста (чувствительна),
- 2 красных лунки – рост в присутствии антибиотиков (устойчива),
- лунка с низкой концентрацией антибиотика – красная, лунка с высокой концентрацией антибиотиков – желтая (умеренно устойчива).
Для клиндамицина и пристинамицина используется лишь одна концентрация антибиотика, поэтому возможны только два варианта результата: культура чувствительная или устойчиваяая.
