ОПЫТ № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНА ИЗ МОЛОКА
Принцип метода: В молоке содержится специфический белок казеин, содержащий фосфор. 80% всех белков молока приходится на долю казеина. Этот белок обладает кислыми свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении казеин выпадает в осадок в виде белых рыхлых хлопьев, которые фильтрованием отделяются от раствора.
Ход работы: В стакан (50 мл) отмеряют 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. После перемешивания добавляют 10 1% НС1, т.к. в избытке соляной кислоты осадок казеина растворяется. Перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут до образования рыхлого осадка.
Для удаления соляной кислоты в стакан приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. Процедуру повторяют. Осадок фильтруют через бумажный фильтр.
ОПЫТ № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ КАЗЕИНА
Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами, поэтому диссоциируют с образованием как положительно, так и отрицательно заряженных групп. При определении рН среды можно добиться такого соотношения ионизированных групп, при котором белковый раствор наименее устойчив и белок выпадает в осадок.
Ход работы: В 5 пробирок приливают из бюретки следующие количества 0,1 н. раствора уксусной кислоты: в первую - 0,25 мл; во вторую - 0,5 мл; в третью -1,0 мл; в четвертую - 2,0 мл; в пятую - 4,0 мл. Из другой бюретки в той же последовательности в каждую пробирку прибавляют 8,75 мл; 8,5 мл; 8,0 мл; 7,0 мл и 5,0 мл воды.
В каждую из пробирок приливают пипеткой по 1 мл раствора казеина и наблюдают
за степенью помутнения раствора.
| № п/п | Реактив | |||||
| 1. | 0,1 н. р-р СНзСООН | 0,25 | 0,5 | 1,0 | 2,0 | 4,0 |
| 2.. | Вода | 8,75 | 8,5 | 8,0 | 7,0 | 5,0 |
| 3. | 0,4% р-р казеина | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| 4. | рН | |||||
| 5. | Степень помутнения |
Результаты: _______________________________________________________________
__________________
Выводы: ________________
ОПЫТ№3. ОСАДОЧНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
3.1. Осаждение белков при кипячении.
Принцип метода. Для осаждения белка необходимо разрушить его гидратную оболочку и нейтрализовать его заряд. При кипячении происходит денатурация, разрушается гидратная оболочка. Белок теряет заряд, если рН раствора близок к изоэлектрической точке этого белка.
Ход работы. В 5 пробирок вносят по 5 капель раствора яичного белка. Затем добавляют:
во вторую пробирку - 1 каплю уксусной кислоты;
в третью - 10 капель уксусной кислоты;
в четвертую - 5 капель уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлорида
натрия;
в пятую - 2 капли гидроксида натрия.
Все пробирки кипятят 5 минут в водяной бане.
Результаты:
| № пробирк и | Реакция среды | Наличие факторов стабилизации | |||
| Гидратная оболочка (есть/нет) | Заряд (есть «+» или «-»/ нет) | ||||
| 1. | Нейтральная | ||||
| 2. | Слабокислая | ||||
| 5. | Сильнокислая | ||||
| 4. | Кислая + электролит | ||||
| 5. | Щелочная |
Выводы: ________________________
3.2. Осаждение белка ацетоном
Ход работы. В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 0,5 мл ацетона, осторожно наслаивая по стенке пробирки.
Результаты: _____________
Выводы: ________________________
3.3. Осаждение белков спиртом
Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, добавляют несколько кристаллов хлорида натрия (NаС1) и приливают 5 мл этилового спирта.
Результаты: _____________
Выводы: ________________________
3.4. Осаждение белка органическими кислотами
Принцип метода: органические кислоты, такие как трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты, вызывают денатурацию и осаждение белка.
Ход работы: В пробирку наливают 5 капель раствора белка, затем добавляют 3-4 капли 8% трихлоруксусной кислоты (ССl3СООН).
Результаты: ________________________________________________________________ _____________
Выводы: _______________________
3.5. Осаждение белка концентрированной азотной кислотой
Принцип метода: Концентрированная азотная кислота вызывает денатурацию белка и его осаждение. Осадок белка не растворяется в избытке азотной кислоты.
Ход работы: В пробирку вносят 10 капель концентрированной азотной кислоты, затем осторожно из пипетки наслаивают по стенке пробирки примерно 1 мл раствора белка так, чтобы жидкости не смешивались.
Результаты: ____________
Выводы: _____________________________________________________________________
3. б. Осаждение белка солями тяжелых металлов
Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора белка, осторожно, по каплям при встряхивании добавляют раствор сульфата меди (СиS04).
Результаты: _________________________________________________________________
Выводы: ____________________
ОПЫТ № 4. ФРАКЦИОННОЕ ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ
Принцип метода:
Ход работы: К 1 мл неразбавленного яичного белка добавляют 6 мл воды. Образуются небольшое количество белого хлопьевидного осадка глобулинов. Глобулины могут растворяться в слабых растворах солей и не растворяются в дистиллированной воде.
В пробирку наливаем несколько капель насыщенного раствора (NН4)2SO4, после чего происходит растворение выпавшего глобулина.
К 1 мл данного раствора яичного белка. Содержащего альбумины и глобулины приливаем 1 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4. Вьпадает осадок глобулинов. Который удаляется фильтрованием.
К фильтрату добавляем кристаллический сульфат аммония до полного насыщения. Образуется осадок яичного альбумина. Который всплывает вверх вследствие высокой плотности жидкости. Осаждение белков солями является обратимым процессом и при добавлении воды белки снова растворяются.
Результаты опыта и выводы оформляют в виде таблицы:
| Название белка | Степень насыщения (NH4)2SO4 | Результаты опыта | Выводы |
| Яичный белок | 50% | ||
| Яичный белок | 100% |
ОПЫТ № 5. ДИАЛИЗ БЕЛКОВ
Принцип метода: Очень удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например от избытка солей после высаливания, является диализ.
Диализом называют процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и т.д.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.
Ход работы: В пробирку наливают 1 мл раствора яичного альбумина и прибавляют к раствору 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, переносят в пробирку и растворяют физиологическим раствором.
Из листа целлофана, предварительно смоченного дистиллированной водой, делают мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки.
Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывая палочки, зажимающие мешочек, на края стакана. Необходимо проследить за тем, чтобы уровень жидкости в мешочке был ниже уровня жидкости в стакане.
Через 1 час после диализа берут в две пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:
а) на присутствие SО42-: добавляют в первую пробирку 3-4 капли 5%-ного раствора ВаСl2.
б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию.
Жидкость из_ мешочка сливают в пробирку (диализат), отмеривают 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию.
Результаты: ____________
Выводы:____________________
