Культуральный метод исследования

9.1. Принципиальная схема культурального метода исследования

Содержание культурального метода исследования, естественно, зависит от того вида микроорганизмов, который в его процессе выделяется и идентифицируется. Однако в принципе все виды бактерий выделяются и идентифицируются по единому алгоритму, состоящему из трех этапов. Содержимое этих этапов значительно отличается лишь в случае анаэробных бактерий. При выделении спороносных бактерий (бацилл и клостридий) проводится предварительная процедура, отсутствующая в случае работы с бактериями, не образующими спор.

А. Цель предварительного этапа – выделение из патологического материала спороносных бактерий.

1. Из имеющих медицинское значение аэробных и факультативно-анаэробных бактерий спорами обладают бациллы.

а. На предварительном этапе патологический материал микроскопируется. Бациллы, благодаря наличию споры, не превышающей диаметр бактериальной клетки, можно по мазку идентифицировать до рода. Однако, поскольку в организме человека и животных бациллы спор не образуют, в патологическом материале, представляющем собой жидкости или ткани живого организма, бактерий со спорами можно и не обнаружить. Другими словами, микроскопия патологического материала в данном случае имеет только ориентировочное значение.

б. Затем патологический материал, предварительно разделив на две порции, засевают в жидкую питательную среду.

1. Первая порция засевается после предварительного прогревания примерно 15 минут при 80⁰С. В этих условиях вегетативные бактериальные клетки погибают, а споры – нет. Вырасти после такой обработки может только спороносные бактерии.

2. Вторую порцию патологического материала засевают на питательную среду без всякой предварительной обработки – в нативном виде. Если спороносную культуру не удастся выделить из первой порции, придется выделять ее из смешанной культуры, выросшей в результате засева нативного патологического материала.

2. Из имеющих медицинское значение строгих и аэротолерантных анаэробных бактерий спорами обладают клостридии.

а. На предварительном этапе патологический материал микроскопируется. Клостридии, благодаря наличию споры, превышающей диаметр бактериальной клетки, можно по мазку идентифицировать до рода. Однако, поскольку в организме человека и животных клостридии, как и бациллы, спор не образуют, в патологическом материале, представляющем собой жидкости или ткани живого организма, бактерий со спорами можно и не обнаружить. Другими словами, микроскопия патологического материала и в данном случае имеет только ориентировочное значение.

б. Затем патологический материал, предварительно разделив на две порции, засевают в среду Кита-Тароцци, действуя аналогично выделению бацилл.

1. Первая порция засевается после предварительного прогревания примерно 15 минут при 80⁰С. В этих условиях вегетативные бактериальные клетки погибают, а споры – нет. Вырасти после такой обработки может только культура спороносных бактерий.

2. Вторую порцию патологического материала засевают на питательную среду без всякой предварительной обработки – в нативном виде. Если спороносную культуру не удастся выделить из первой порции, придется выделять ее из смешанной культуры, выросшей в результате засева нативного патологического материала.

Б. Цель первого этапа – получение изолированного роста, т.е. собственно чистой культуры.

1. С этого этапа начинается культуральный метод диагностики при выделении аэробных и факультативно-анаэробных бактерий (за исключением бацилл).

а. Прежде всего патологический материал микроскопируется. Микроскопия патологического материала и в данном случае имеет только ориентировочное значение.

б. Затем патологический материал засевается на плотную питательную среду с таким расчетом, чтобы получить рост в виде отдельных колоний (так называемый изолированный рост). Сделать это можно или засевая материал бактериологической петлей штрихом или бактериологическим шпателем по Дригальскому.

1. При засеве штрихом поверхность питательного агара в чашке Петри мысленно делиться на четыре сектора. Сначала несколькими параллельными штрихами, каждый раз отрывая петлю от поверхности среды, засевается первый сектор (Рис. 9-1). Затем петля стерилизуется в пламени горелки и материал первого сектора распределяется по поверхности второго сектора такими же несколькими штрихами, после каждого из которых петлю следует отрывать от поверхности питательной среды (Рис. 9-2). Подобным образом засеваются третий и четвертый сектора (Рис. 9-3 и 9-4), в результате чего после инкубирования в термостате мы получаем изолированный рост, т.е. рост в виде отдельных изолированный друг от друга колоний в первом, втором, третьем или, в крайнем случае, четвертом секторе – в зависимости от концентрации бактериальных клеток в посевном материале (Рис. 9-5).

Рис. 9-1. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев первого сектора	Рис. 9-2. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев второго сектора
Рис. 9-3. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев третьего сектора	Рис. 9-4. Засев штрихом для получения изолированного роста: засев четвертого сектора
Рис. 9-5. Засев штрихом для получения изолированного роста: результат засева (изолированный рост в третьем и четвертом секторах)

2. При засеве по Дригальскому капля патологического материала распределяется бактериологическим шпателем по поверхности пластинчатого агара. Затем оставшийся на шпателе посевной материал распределяется по поверхности пластинчатого агара во второй чашке Петри, а затем таким же образом засевается третья чашка Петри. В зависимости от концентрации бактериальных клеток в посевном материале, изолированный рост будет или в первой или во второй или, в крайнем случае, в третьей чашке с пластинчатым агаром.

2. С этого же этапа начинается культуральный метод диагностики при выделении строгих и аэротолерантных анаэробных бактерий (за исключением клостридий).

а. Прежде всего патологический материал микроскопируется. Микроскопия патологического материала и в данном случае имеет только ориентировочное значение.

б. Затем патологический материал засевается на плотную питательную среду с таким расчетом, чтобы получить рост в виде отдельных колоний (так называемый изолированный рост). Сделать это можно или по методу Цейсслера или по методу Вейнберга.

1. Засев анаэробов по методу Цейсслера аналогичен изложенному выше методу засева шпателем по Дригальскому. Чашки после засева помещают в анаэростат или другое устройство, позволяющее культивировать бактерии в анаэробных условиях. Метод можно применять для выделения аэротолерантных бактерий, но он не подходит для выделения строгих анаэробов, так как в момент засева бактерии контактируют с атмосферным воздухом.

2. Засев по методу Вейнберга подходит для выделения как строгих, так и аэротолерантных бактерий. Заключается он в последовательном разведении посевного материала в ряде пробирок с расплавленной и остуженной агаризованной питательной средой с последующим быстрым ее охлаждением для глубинного культивирования (см. выше метод создания анаэробных условий культивирования «трубки Виньяль-Вийона»).

В. Цель второго этапа – накопление чистой культуры. Необходимость этого этапа обусловлена тем, что материала одной колонии – чистой культуры, полученной на предыдущем этапе – в подавляющем числе случаев недостаточно для ее окончательной идентификации.

1. При выделении аэробов и факультативных анаэробов на этом этапе изучают выросшие изолированные колонии и отбирают из них одну или несколько для последующей работы. Затем выбранную колонию мысленно делят на три части: из одной трети делают мазок, вторую используют для постановки реакции агглютинации, а оставшуюся засевают на новую питательную среду (чаще всего – на скошенный агар).

а. Изучение колонии играет очень важную роль, так как зачастую определяет успешность всей последующей работы по идентификации выделенной культуры; особенно в тех случаях, когда из патологического материала необходимо выделить конкретный вид.

1. Сначала колонию изучают в проходящем свете – сквозь дно чашки Петри и слой питательной среды (если степень прозрачности использованной питательной среды позволяет это сделать).

а. Определяют размер, т.е. диаметр колонии.

б. Оценивают форму ее очертаний.

в. Регистрируют степень прозрачности колонии.

2. Затем колонию изучают в отраженном свете – сквозь крышку чашки Петри или, слегка приоткрыв ее, чуть сбоку. Последний вариант с одной стороны более опасен и в отношении внутрилабораторного заражения проводящего исследование и в отношении контаминации выросшей культуры микроорганизмами воздуха лаборатории, но с другой – позволяет более адекватно оценить мельчайшие подробности внешнего вида колонии, а также уловить ее запах, что в ряде случае также несет информацию о природе выросшей культуры.

а. Определяют цвет колонии.

б. Описывают характер поверхности колонии.

в. Регистрируют положение колонии на питательной среде.

3. Заканчивают изучение колонии, просматривая ее краевую зону под микроскопом на малом увеличении.

а. Определяют характер края колонии.

б. Описывают структуру колонии.

б. Мазок из колонии необходим для выявления морфологических свойств выделяемой культуры. Как правило, мазок окрашивают по Граму.

в. Реакцию агглютинации на этом этапе проводят на стекле, суспензируя материал колонии в капле диагностической сыворотки. Если используется поливалентная сыворотка, то такую реакцию называют ориентировочной, так как определяется не конкретный серовар, а группа сероваров, к которой относится идентифицируемый вариант.

г. Наконец, оставшуюся часть колонии засевают густым штрихом на, например, скошенный агар с тем, чтобы получить большое количество бактериальной массы для проводимых на последнем этапе многочисленных методов идентификации.

2. При выделении строгих и аэротолерантных анаэробов на этом этапе также изучают выросшие изолированные колонии и отбирают из них одну или несколько для последующей работы. Затем выбранную колонию мысленно делят на три части: из одной трети делают мазок, вторую используют для постановки реакции агглютинации, а оставшуюся засевают на новую питательную среду.

а. Изучение колонии проводят аналогично изложенной выше процедуре для аэробных бактерий. Однако если колония получена в результате глубинного культивирования, то изучить ее в отраженном свете технически недоступно – в этих случаях не оценивают ни характер ее поверхности, ни положение ее на питательной среде.

б. Мазок из колонии так же, как в случае с аэробами окрашивают чаще всего по Граму.

в. Реакцию агглютинации проводят так же, как и при выделении аэробов. Однако если выделяют клостридии, то агглютинировать колонию нет необходимости, потому что серологические свойства бактериальной клетки для их идентификации не используются.

г. Для накопления чистой культуры анаэробов материал изолированной колонии засевают на среду Китта-Тароцци.

Г. Цель третьего этапа – окончательная идентификация чистой культуры.

1. При выделении облигатных аэробов и факультативных анаэробов изучают культуру, выросшую на скошенном агаре.

а. Прежде всего, накопленную культуру проверяют на чистоту путем микроскопирования приготовленного из нее мазка.

б. Затем проводят серологическую идентификацию культуры до серовара (если это необходимо), с помощью реакции агглютинации с моновалентными сыворотками.

в. Для изучения биохимических свойств культуру засевают на специальные питательные среды.

г. Определяют также вирулентность культуры (см. ниже раздел «Выявление и оценка вирулентности»).

д. И наконец, в случае необходимости, определяют эпидемиологические маркеры выделенной чистой культуры (такие, как фаготип, колицинотип и др.), включая антибиотикограмму (чувствительность выделенной культуры к антибиотикам).

2. При выделении строгих и аэротолерантных анаэробов изучают культуру, выросшую на среде Китта-Тароцци.

а. Прежде всего, как и при выделении аэробов, накопленную культуру проверяют на чистоту путем микроскопирования приготовленного из нее мазка.

б. Затем проводят серологическую идентификацию культуры до серовара (если это необходимо), с помощью реакции агглютинации с моновалентными сыворотками. В случае выделения клостридий серовар определяют по типу белкового токсина в реакции нейтрализации (этот метод разбирается в курсе иммунологии, а также – в применении именно к клостридиям – в курсе медицинской бактериологии).

в. Для изучения биохимических свойств культуру засевают на специальные питательные среды.

г. Определяют также вирулентность культуры (см. ниже раздел «Выявление и оценка вирулентности»). Особенно это важно в случае выделения клостридий, которые идентифицируются именно по одному из факторов вирулентности – белковому токсину.

д. И, наконец, при необходимости, определяют эпидемиологические маркеры выделенной чистой культуры, включая антибиотикограмму (чувствительность выделенной культуры к антибиотикам).

Д. Многие современные лаборатории оснащены приборами автоматической идентификации бактериальных культур, такими, как гемокультиватор BACTEC (Рис. 9-6 и 9-7), микробиологический анализатор PHOENIX (Рис. 9-8 и 9-9). В этом случае работа врача-бактериолога значительно облегчается, он освобождается от проведения многих однообразных и требующих больших временных затрат процедур, а его рабочее место больше напоминает рабочее место современного менеджера (Рис. 9-10 и 9-11). Однако и в этом случае принцип проведения культурального метода исследования полностью совпадает с изложенным в этом разделе, лишь второй и третий этапы осуществляются без участия человека – они практически полностью автоматизированы. Но при этом следует помнить, что компьютер может работать только с той информацией, которую в него «вложил» человек, поэтому если какой-либо вид микроорганизма по той или иной причине не внесен в программу автоматического анализатора, работа по его выделению и идентификации проводится по изложенному в этом разделе классическому алгоритму.

 

Рис. 9-6. Гемокультиватор BACTEC (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы)	Рис. 9-7. Гемокультиватор BACTEC в раскрытом виде (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы)
Рис. 9-8. Микробиологический анализатор PHOENIX (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы)	Рис. 9-9. Микробиологический анализатор PHOENIX в раскрытом виде (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы)
Рис. 9-10. Рабочее место бактериолога-преаналитика (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы)	Рис. 9-11. Рабочее место бактериолога (при регистрации результатов анализа) (клинико-диагностическая лаборатория Гродненской областной клинической больницы)

9.2. Культуральные признаки бактерий

Культуральные признаки – это вторая, вслед за морфологическими, группа признаков, используемых для описания и, соответственно, идентификации бактериальной культуры.

А. Питательные потребности описываются, прежде всего, как простые (способность к росту на простых натуральных питательных средах) или сложные (необходимость использования для культивирования культуры сложной натуральной питательной среды). Кроме того, при характеристике сложных питательных потребностей приводят список тех сред, к росту на которых способна данная бактериальная культура.

Б. Оптимальная питательная среда – эта среда, наиболее подходящая для культивирования данного вида бактерий. Даже для культивирования бактерий с простыми питательными потребностями могут быть разработаны сложные питательные среды, на которых данный вид растет лучше, чем на простых средах.

В. Температура культивирования – оптимальная температура для более быстрого роста данного вида.

Г. Условия аэрации – состав газовой смеси, наиболее полно отвечающей физиологическим потребностям данной культуры. Такая атмосфера культивирования позволяет получить более быстрый рост культуры (см. раздел 8.4).

Д. Скорость роста – время появления видимого роста (налета, колоний, мути – в зависимости от консистенции питательной среды и концентрации инокулята) после посева бактериальной культуры. Зависит от времени, затрачиваемой бактериальной клеткой на одно деление (например, у кишечной палочки – примерно 20 минут, у туберкулезной палочки – примерно 18 часов), которая, в свою очередь, является производным и качества питательной среды и условий культивирования. При характеристике вида дается его скорость роста на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования.

Е. Характер роста на жидких и плотных питательных средах – очень важный культуральный признак, о нем говорилось выше (раздел 8.5).

 

9.3. Изучение биохимических свойств бактерий (на примере энтеробактерий)

Биохимические свойства бактерий можно начинать изучать одновременно с выделением культуры, засевая материал на специальные питательные среды, позволяющие судить о биохимической активности выделяемых микроорганизмов. Наиболее показателен в этом отношении культуральный метод диагностики инфекций, вызываемых энтеробактериями: так как сотни входящих в это семейство видов практически идентичны друг другу по морфологическим и культуральным свойствам, их биохимический свойства играют очень большую роль в процессе идентификации. Именно на этом примере мы и разберем данный вопрос.

А. На первом этапе патологический материал засевают на дифференциально-диагностические среды для кишечной группы бактерий. В состав этих сред, наряду с мясопептонным агаром, входит лактоза и индикатор. Если бактерия способно ферментировать лактозу (важный признак для дифференциации различных энтеробактерий), рН среды смещается в кислую сторону и индикатор окрашивает колонию в соответствующий цвет. В нашей стране наиболее распространены среды Эндо, Левина и Плоскирева; в других странах могут использоваться аналогичные среды, принцип действия которых, однако, идентичен этим трем.

1. Среда Эндо (в англоязычной литературе “Endo Agar”) содержит индикатор основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия.

а. Лактозопозитивные колонии на среде Эндо – красные (кишечная палочка с типичной биохимической активностью образует на этой среде темно-красные колонии с металлическим блеском, схожим с блеском ртути).

б. Лактозонегативные колонии на среде Эндо бесцветные, но так как энтеробактерии образуют прозрачные и полупрозрачные колонии, то они могут приобретать оттенок той среды, на которой вырастают.

2. Среда Левина содержит К₂НРО₄, метиленовый синий и эозин. В англоязычной литературе более употребительное название для этой среды “Eosin Methylene Blue Agar”, иногда – “Eosin Methylene Blue Agar (Levine)”.

а. Лактозопозитивные колонии на среде Левина – насыщенного синего цвета.

б. Лактозонегативные колонии на среде Левина бесцветные.

3. Среда Плоскирева содержит кроме лактозы и индикатора (нейтрального красного) еще и бриллиантовый зеленый, соли желчных кислот, минеральные соли. Раньше эту среду часто называли «бактоагар Ж». За рубежом аналогом этой среды выступает “MacConkey Agar”.

а. Лактозопозитивные колонии на среде Плоскирева – красные.

б. Лактозонегативные колонии на среде Плоскирева бесцветные.

Б. На II этапе отобранную для дальнейшей работы колонию засевают на среды накопления и первичной дифференциации. Эти среды содержат уже несколько субстратов, по отношению к которым определяется ферментативная активность изучаемой бактериальной культуры, кроме того, эти среды формируются в пробирки так, чтобы получился участок со столбиком и участок скошенного агара (Рис. 9-12). Изучаемая колония засевается в столбик уколом, а на скошенную часть среды – плотным штрихом.

1. Среда Рессела содержит глюкозу и лактозу.

а. Если культура ферментирует только глюкозу, не ферментируя лактозу, то измениться цвет только столбика, без изменения цвета скошенной части.

б. Если культура ферментирует и глюкозу и лактозу, то изменится цвет всей среды – и столбика и скошенной части.

2. Среда Клиглера содержит не только глюкозу и лактозу, но и ингредиенты, позволяющие определить наличие сероводорода.

а. Если культура ферментирует только глюкозу, не ферментируя лактозу, то измениться цвет только столбика, без изменения цвета скошенной части (Рис 9-13).

б. Если культура ферментирует и глюкозу и лактозу, то изменится цвет всей среды – и столбика и скошенной части (Рис 9-14).

в. Если культура продуцирует сероводород, место засева уколом чернеет (Рис 9-15).

 

Рис. 9-12. Среда Клиглера: незасеянная.

Рис. 9-13. Среда Клиглера: рост бактериальной культуры, ферментирующей глюкозу (изменения цвета столбика) и не ферментирующей лактозу (скошенная часть свой цвет не меняет)

Рис. 9-14. Среда Клиглера: рост бактериальной культуры, ферментирующей и глюкозу (изменения цвета столбика) и лактозу (скошенная часть также меняет свой цвет)

Рис. 9-15. Среда Клиглера: рост бактериальной культуры, продуцирующей сероводород (место укола чернеет – в случае выраженной продукции сероводорода, как в данном случае, учет сахаролитической активности невозможен)

 

3. Среда Олькеницкого по составу аналогична среде Клиглера, но в нее вводится еще и мочевина (с индикатором щелочения, так как при ферментации мочевины образуется аммиак). Эту среду называют еще «трехсахарным агаром», так как в ее состав входит еще и сахароза, однако отдельно ферментацию сахарозы на этой среде не определяют.

а. Если культура ферментирует только глюкозу, не ферментируя лактозу, то измениться цвет только столбика, без изменения цвета скошенной части.

б. Если культура ферментирует и глюкозу и лактозу, то изменится цвет всей среды – и столбика и скошенной части.

в. Если культура продуцирует сероводород, место засева уколом почернеет.

г. Наличие уреазной активности определяется по покраснению среды (Рис 9-16).

 

Рис. 9- 16. Определение уреазной активности с помощью среды Олькеницкого. Среду засевают (уколом в столбик и штрихом по скошенной части) испытуемой культурой; в случае ферментации бактериями мочевины среда краснеет (слева), если бактерии мочевину не ферментируют – покраснения среды не наблюдается (справа).

 

В. На III этапе биохимические свойства выделенной культуры изучаются более детально.

1. Сахаролитические свойства изучаются на средах Гисса. Среда Гисса представляет собой столбик полужидкого агара (засевается уколом), в состав которого входит определенный углевод и индикатор. Принцип действия среды Гисса аналогичен принципу действия вышеописанных сред, но так как среда полужидкая, то в положительном случае (ферментации данного углевода) она полностью меняет цвет. Конкретная световая гамма сред Гисса зависит от вводимого в их состав индикатора (индикатор Андреде обуславливает переход от синего, если углевод не утилизируется, к красному, при утилизации углевода; индикатор ВР – водный голубой и розоловая кислота – наоборот, от красного к синему и т.п.). Совокупность сред Гисса, используемых для засева бактериальной культуры, называется рядом Гисса или пестрым рядом.

а. Наиболее информативны при дифференциации энтеробактерий пять углеводов: лактоза, глюкоза, манит, мальтоза и сахароза. Пять сред Гисса с этими углеводами называют коротким рядом Гисса (во всех баклабораториях бывшего Советского Союза они располагаются в штативе именно в таком порядке, в котором они здесь перечислены, что позволяет легче визуализировать результат анализа).

б. В случае необходимости определяют способность изучаемой культуры ферментировать и большее количество субстратов (моносахаридов, полисахаридов, спиртов). Тогда говорят о длинном ряде Гисса.

2. Протеолитические свойства бактериальной культуры определяют, засевая ее на среды с белковыми субстратами (желатин, пептон и др.).

а. Желатин используется как показатель наличия или отсутствия у изучаемой бактериальной культуры протеолитической активности как таковой.

1. Если бактерии обладают протеолитической активностью, то они будут разжижать столбик желатина, засеваемый уколом. При этом для идентификации некоторых видов значение имеет и то, как именно разжижается желатин (послойно, перевернутой елочной, воронкой и т.п.).

2. Бактерии, не обладающие протеолитической активностью, желатин не разжижают.

б. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) индол.

1. Для определения продукции бактериальной культурой индола применяется способ Мореля. Культуру засевают в мясопептонный бульон или пептонную воду (лучше с добавлением триптофана, при утилизации которого выделяется значительное количество этого газа) и под пробку помещают фильтровальную бумагу, пропитанную щавелевой кислотой.

а. При продукции бактериальной культурой индола нижняя часть бумажки краснеет.

б. Если культура не продуцирует индол – бумажка остается бесцветной.

2. Более надежен способ Эрлиха. В пробирку с изучаемой культурой добавляют специальный реактив (Рис. 9-17).

 

Рис. 9-17. Проба на выявление способности бактериальной культуры продуцировать индол. Столбик полужидкого агара засевается уколом, после появления роста поверхность среды заливается специальным реактивом; при наличии индола реактив краснеет (слева), при отрицательной пробе – остается бесцветным (справа)

 

а. В присутствии индола реактив краснеет.

б. Если индола нет – реактив остается бесцветным.

в. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) аммиак. Для выявления этого признака под пробку пробирки с засеянной питательной средой помещают лакмусовую бумагу так, чтобы она не касалась поверхности среды.

1. При образовании аммиака лакмусовая бумажка синеет.

2. Если аммиак не образовывается, лакмусовая бумажка цвет не изменяет.

г. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) сероводород.

1. С этой целью под пробку пробирки с засеянной питательной средой помещают фильтровальную бумагу, пропитанную ацетатом свинца.

а. При продукции бактериальной культурой сероводорода нижняя часть бумажки чернеет.

б. Если культура не продуцирует сероводород – бумажка остается бесцветной.

2. Однако, метод с использованием бумажки с ацетатом свинца не надежен и в настоящее время практически не используется. Продукцию бактериями сероводорода лучше определять с помощью сред Клиглера или Олькеницкого (см. выше).

2. В ряде случаев для идентификации выделенной бактериальной культуры необходимо определить продуцирует ли она конкретные ферменты. Чаще всего выясняется наличие оксидазной и каталазной активностей.

а. Оксидазная активность определяется с помощью специального реактива, которым смачивается полоска фильтрованной бумаги Рис. 9-18.

 

Рис. 9-18. Оксидазный тест. На специальную индикаторную бумажку наносится бактериальная культура; в случае положительной оксидазной активности в месте соприкосновения с бактериальной культурой индикаторная бумажка меняет цвет (справа)

 

1. В положительном случае она меняет цвет.

2. При отсутсвии оксидазы цвет индикатора не меняется.

б. Для определения каталазной активности культуру вносят в каплю перекиси водорода на предметном стекле Рис. 9-19.

 

Рис. 9-19. Проба на выявление каталазной активности. На предметное стекло помещается капля перекиси водорода, в которой суспензируется тестируемая культура; если бактерии обладают каталазной активностью, то наблюдается бурное газообразование (слева), если нет – газ практически не выделяется (справа).

 

1. Каталаза, продуцируемая бактериями, будет разлагать перекись водорода на воду и кислород, выделение которого в виде пузырьков и регистрируется.

2. Если каталазной активности у бактериальной культуры нет, пузырьков не будет.

БАКТЕРИОФАГИ

Бактериофагами (или просто фагами) называются вирусы, поражающие прокариотическую клетку. Традиционно они рассматриваются в курсе вирусологии, но так как они по своей структуре во многом отличаются от вирусов животных и человека, а, главное, так как в медицинской бактериологии они в основном используются в ходе культурального метода для идентификации бактерий, мы рассмотрим их в курсе общей микробиологии и именно после разбора культурального метода диагностики. Кроме того, бактериофаги играют значительную роль в генетике бактерий, вследствие чего их логично рассматривать перед изложением соответствующего раздела.

10.1. Открытие, номенклатура и структура бактериофагов

Бактериофаги были открыты вскоре после эпохального (как, впрочем, выяснилось позднее) открытия Ивановского; однако их структура и особенности взаимодействия с бактериальной клеткой прояснились лишь на переломе ХХ века.

А. Бактериофаги открыл д’Эрелль в 1917 году.

Б. Номенклатура фагов основана на видовом наименовании хозяина. Это значит, что название конкретного бактериофага – это название того вида бактериального вида, которые является основным хозяином данного фага, с добавлением буквенного, или числового, или буквенно-числового обозначения (например: Escherichia coli λ, Escherichia coli Т2 и т.п.).

В. Структура бактериофага может быть в принципе описана как нуклеиновая кислота, окруженная белковой оболочкой. То есть (как будет видно из курса вирусологии), это структура простого вируса. Как и у всех вирусов, в составе бактериофага может быть только один тип нуклеиновой кислоты – или ДНК или РНК.

1. Нуклеиновая кислота бактериофага содержится в его головке – икосаэдральной структуре (схожей с формой простых вирусов – см. соответствующий раздел вирусологии), формирующей вокруг нуклеиновой кислоты белковую оболочку.

2. Кроме головки бактериофаг может иметь отросток – трубчатую белковую структуру, через которую нуклеиновая кислота внедряется в клетку, к которой прикрепился бактериофаг.

3. В дополнение к этим двум основным структурным элементам бактериофаги могут иметь дополнительные структуры – например, базальную пластинку, концевые нити и т.д. (Рис. 10.1-1 и 10.1-2).

Рис. 10.1-1. Бактериофаг Т2 (схема строения)

Рис. 10.1-2. Бактериофаг Т2 (электронная микроскопия – объемная фотография)

 

10.2. Морфологические типы бактериофагов

В зависимости от наличия и характера основных структурных компонентов – головки и отростка – бактериофаги подразделяются на морфологические типы, в пределах которых, в свою очередь, возможны различные варианты, что делает мир бактериофагов очень разнообразным (Рис. 10.2-1).

Рис. 10.2-1. Различные морфологические типы бактериофагов.

 

А. Бактериофаг может иметь только один из основных структурных компонентов. Такие бактериофаги иногда называют простыми.

1. Нитчатые бактериофаги не имеют головки и представлены только отростком – это I морфологический тип бактериофагов.

2. Бактериофаги, имеющие только головку, без отростка, составляют II морфологический тип.

Б. Бактериофаги, имеющие и головку и отросток, иногда называют сложными.

1. Отросток у бактериофагов может быть коротким и без чехла – такие бактериофаги относятся к III морфологическому типу.

2. Отросток у бактериофагов может быть длинным и с чехлом.

а. Если отросток при этом не может сокращаться, то такие бактериофаги относятся к IV морфологическому типу.

б. Бактериофаги, обладающие сократительным отростком, относятся к V морфологическому типу.

10.3. Классификация бактериофагов по спектру действия

Чем большее количество видов и вариантов бактерий может поражать данный бактериофаг, тем шире его спектр действия.

А. Бактериофаги, поражающие несколько видов бактерий, называются полифагами. Такие фаги встречаются относительно редко.

Б. Более многочисленны монофаги – такие бактериофаги могут поражать особей только одного вида (поэтому их часто называют видовыми бактериофагами).

В. Но наиболее многочисленны типовые бактериофаги – они поражают не всех особей данного вида, а только часть их. Именно в зависимости от чувствительности к таким бактериофагам выделяют внутри одного вида различные фаговары (или, в более старом варианте термина, фаготипы).

10.4. Вирулентный, умеренный, дефектный бактериофаги

По особенностям взаимодействия с чувствительной клеткой выделяют вирулентный и умеренный бактериофаги. Кроме этого, бактериофаг может полностью или частично заменять свой геном на участок генома бактериальной клетки – хозяина: такие бактериофаги называются дефектными.

А. Вирулентный бактериофаг вызывает лизис клетки, в которой он реплицируется, с выходом многочисленного (до 200 фаговых корпускул) потомства.

Б. Умеренный бактериофаг вызывает лизогенизацию пораженной им бактериальной клетки – интегрируется в ее геном (превращается в профаг), репрессируется и реплицируется в его составе. Как результат, профаг присутствует во всех клетках, образующихся в результате деления лизогенной клетки. Спустя определенное, иногда очень длительное, время может произойти дерепрессия профага (так называемая индукция фага), в результате чего умеренный бактериофаг, подобно вирулентному, вызовет лизис клетки с выходом большого числа фаговых корпускул.

1. Профаг может репрессироваться полностью. В этом случае фенотип лизогенной бактерии не меняется.

2. Некоторые профаги репрессируются не полностью – с определенного гена профага снимается информация, а, следовательно, лизогенная бактерия приобретает в результате лизогенизации дополнительный признак. Такое явление (изменение фенотипа бактерии в результате лизогенизации) называется фаговой конверсией.

В. Среди образующихся при лизисе клетки вирулентных или (при индукции профага) умеренных бактериофагов всегда присутствует некоторое количество фаговых корпускул, несущих, вместо полноценной нуклеиновой кислоты бактериофага, фрагмент нуклеиновой кислоты бактериальной клетки или нуклеиновую кислоту бактериофага, в которой небольшой участок заменен на фрагмент нуклеиновой кислоты бактериальной клетки. Такие бактериофаги, вследствие дефекта своего генома, уже никогда не смогут вызвать лизиса бактериальной клетки, которую они поразили. Такие бактериофаги и называются дефектными. Дефектные бактериофаги переносят участок генома от одной бактериальной клетки к другой. Этот процесс называется трансдукцией (перенос генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью дефектного бактериофага), поэтому дефектные бактериофаги часто называют еще и трансдуцирующими.

1. Дефектные бактериофаги, «произошедшие» от вирулентных фагов, содержат в своем составе вместо нуклеиновой кислоты фага участок нуклеиновой кислоты «родительской» бактерии. Причем, в фаговый корпускул может быть включен любой – случайный – участок генома бактерии. Следовательно, такой фаг может передавать любой признак.

а. Участок нуклеиновой кислоты, внесенный таким дефектным фагом в бактериальную клетку, чаще всего не интегрируется в бактериальную хромосому и при делении клетки переходит в одну из вновь образованных особей. Понятно, что спустя некоторое время бактерия, обладающая признаком, детерминированным фагом, просто потеряется среди массива особей, этим признаком не обладающими. По этой причине такая трансдукция называется абортивной.

б. Реже участок нуклеиновой кислоты, внесенный таким дефектным фагом в бактериальную клетку, интегрируется в бактериальную хромосому и, следовательно, присутствует у всех клеток данного клона. Такая трансдукция называется общей.

2. Дефектные фаги, «произошедшие» от умеренных фагов содержат в своем составе строго определенный участок нуклеиновой кислоты «родительской» клетки и, следовательно, каждый конкретный фаг может передавать строго определенный признак. Такая трансдукция называется специализированной.

 

10.5. Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой

Взаимодействия бактериофага с чувствительной клеткой аналогично взаимодействую вируса с чувствительной клеткой, которое будет разбираться в курсе вирусологии.

А. Бактериофаг адсорбируется на специальных, специфических для конкретного фага, рецепторах клеточной стенки бактериальной клетки. Если бактериальная клетка не имеет рецепторов для адсорбции конкретного бактериофага, то она к нему не чувствительна. Сферопласты также теряют чувствительность к видовым и типовым фагам, поскольку с потерей клеточной стенки теряют и локализованные на ней рецепторы для адсорбции соответствующих бактериофагов.

В. Следующая стадия – проникновение нуклеиновой кислоты бактериофага внутрь бактериальной клетки. Этот процесс в вирусологии называется также депротеинизацией, поскольку внутрь клетки проникает только нуклеиновая кислота вируса, вирус как бы «раздевается», сбрасывая свою белковую оболочку.

Г. В дальнейшем происходит взаимодействие бактериофага с геномом пораженной клетки.

1. Вирулентные бактериофаги вызывают продуктивную инфекцию бактериальной клетки.

а. Происходит репликация фаговой НК и синтез фаговых белков.

б. Затем происходит сборка фаговых частиц (без участия ферментов, по принципу самосборки).

в. Завершается процесс выходом зрелых фагов.

1. Клетка при этом может лизироваться (происходит своеобразный «взрыв» с выходом в окружающую среду фаговых корпускул).

2. Некоторые нитчатые фаги способны выходить из бактериальной клетки не только не вызывая ее лизиса, но клетка при этом даже не погибает.

2. Умеренные бактериофаги вызывают лизогенизацию бактериальной клетки.

1. Нуклеиновая кислота умеренного фага интегрируется в геном бактериальной клетки, превращаясь в профаг.

2. Транскрипция профага репрессируется фаговым репрессором, вследствие чего информация с него не снимается и он реплицируется в составе генома лизогенной бактериальной клетки. Все клетки бактериальной культуры, ведущей начала от такой клетки содержат профаг. Поэтому и культура в целом называется лизогенной.

3. В дальнейшем с профага какой-либо клетки или совокупности клеток лизогенной культуры может начаться процесс снятия информации (такое явление называется индукция профага) и тогда разовьется продуктивная инфекция с лизисом клетки и выходом из нее зрелых корпускул умеренного бактериофага.

 

10.6. Практическое применение фагов

Бактериофаг в медицинской практике применяется в диагностике, лечении и профилактике инфекционных заболеваний.

А. В диагностике бактериофаг применяется при осуществлении культурального метода исследования для определения вида выделенной чистой культуры, также для ее типирования. Изложенный ниже метод использования бактериофага с целью индикации наличия в патологическом материале определенного вида бактерий без выделения его в чистой культуре не получил широкого распространения.

1. Реакция нарастания титра фага основана на способности видового бактериофага реплицироваться только в клетках бактерий «своего» вида. Осуществляется она по следующему принципу. К патологическому материалу добавляют определенное количество видового бактериофага, инкубируют его в термостате, а потом вновь определяют количество фага. Если оно возросло, значит, бактериофаг «нашел» для репликации клетки «своего» вида, следовательно – в патологическом материале присутствуют бактерии искомого вида.

2. В процессе идентификации чистой культуры используют видовые и типовые бактериофаги.

а. Видовые бактериофаги используются для фагоиндикации. Выделенную чистую культуру засевают газоном на пластинчатый агар и капают на него каплю видового бактериофага. Если культура относится к искомому виду, то в месте нанесения капли роста не будет, в противном случае в месте нанесения капли фага будет наблюдаться бактериальный рост (Рис. 10.6-1). Иногда после нанесения бактериофага чашку Петри с пластинчатым агаром наклоняют, давая капле стечь в краю чашки (из-за чего этот метод называют «стекающая капля»).

Рис. 10.6-1. Метод фагоиндикации: в месте нанесения капли бактериофага φ-КХ-32 чувствительный к нему вид Klebsiella planticola не растет (справа внизу видно «стерильное пятно»), клебсиелла другого вида – K. oxytoca – к этому фагу не чувствительна.

 

б. Типовые бактериофаги используются для фаготипирования. Принцип метода заключается в следующем.

1. Типируемый штамм засевают газоном на пластинчатый агар.

2. Затем на засеянную поверхность капают капли типовых бактериофагов (каждую в свой квадрат, помеченный заранее, например, стеклографом на дне чашки Петри).

3. Чашку с посевом инкубируют в термостате.

4. Учитывают опыт, регистрируя «стерильные пятна» или «бляшки» – места отсутствия роста в месте нанесения капли бактериофага, к которому чувствителен данный вариант бактерий (Рис. 10.6-2).

 

Рис. 10.6-2. Стерильные пятна, образованные типовыми бактериофагами

5. Фаговар (фаготип) обозначается путем перечисления типовых фагов, лизирующих данный вариант.

Б. Применение бактериофагов (как правило, видовых) для лечения обозначается термином фаготерапия. С целью лечения бактериофаги применяются местно (в виде орошения пораженной поверхности, вкалывая в локальный очаг патологического процесса и т.п.), так как введение их парентеральным путем приводит к развитию иммунного ответа на чужеродный фаговый белок. Если лечебный бактериофаг применяют перорально (для лечения кишечных инфекций), то лучше всего использовать таблетированную форму препарата, покрытую кислотоустойчивой оболочкой, растворяющейся в щелочной среде кишечника – бактериофаги очень чувствительный к низкому рН и быстро инактивируются в кислой среде желудка.

В. Фагопрофилактика – использование бактериофага (тоже, как правило, видового) для профилактики развития бактериальной инфекции. В настоящее время применяется для экстренной профилактики брюшного тифа и дизентерии (под экстренной профилактикой понимается комплекс мероприятий для предотвращения развития болезни уже после совершившегося акта инфицирования, т.е. попадания возбудителя в организм пациента).

 

10.7. Выделение и титрование бактериофага

В ряде случаев, например, с научными, санитарно-гигиеническими целями или для постановки реакции нарастания титра фага необходимо выделить фаг или из объекта окружающей среды или из бактериальной культуры, а иногда еще и определить его количество в единице объема (этот показатель и определяется термином титр бактериофага).

А. Выделение бактериофага проводят по следующему алгоритму.

1. Материал, их которого выделяется бактериофаг (объект внешней среды или бактериальная культура), фильтруют через бактериальный фильтр.

2. Фильтрат помещают в жидкую питательную среду, куда засевают чувствительную к выделяемому фагу бактериальную культуру.

3. После термостатирования проводят учет опыта.

а. Рост бактерии свидетельствует об отсутствии в исследуемом материале искомого бактериофага.

б. Отсутствие роста бактерий свидетельствует, что искомый бактериофаг в исследуемом материале присутствует.

Б. Титрование бактериофага проводят или по методу Аппельмана или по методу Грациа.

1. Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда.

а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде.

б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой.

в. Посевы инкубируются в термостате.

г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага.

2. Титрованием фага по Грациа можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до одной фаговой корпускулы.

а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в полужидкой питательной среде.

б. К каждому разведению добавляется чувствительная культура с таким расчетом, чтобы в отсутствие бактериофага получился рост в виде газона.

в. Каждое разведение фагосодержащего материала в полужидкой среде с добавлением чувствительной культуры заливается в чашку Петри на слой плотной питательной среды, используемой в роли подложки.

г. Посевы инкубируются в термостате.

д. Низкие разведения бактериофага полностью лизируют бактерии и роста не наблюдается. По мере разведения фага появляются отдельные изолированные бляшки, каждая из которых – результат репликации одной фаговой корпускулы. Для подсчета титра бактериофага следует количество бляшек умножить на то разведение, в котором эти бляшки подсчитаны. (Рис. 10.7-1 и 10.7-2).

Рис. 10.7-1. Бляшки (стерильные пятна, негативные колонии) бактериофага

Рис. 10.7-2. Появление изолированных бляшек по мере разведение фагосодержащего материала

5Г. Тестовые вопросы по теме занятия

Физический метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий:

-использование анаэростата

удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции

совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма

 

Химический метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий:

использование анаэростата

-удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции

совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма

 

Биологический метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий:

использование анаэростата

удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции

-совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма

 

Метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий, который сочетает в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов:

-метод Китта-Тароцци

метод Грациа

метод Аппельмана

метод Вильсона-Блера

метод Цейсслера

 

Первый этап культурального метода исследования:

-получение изолированного роста

накопление чистой культуры

окончательная идентификация чистой культуры

прогрев посевного материала

 

Второй этап культурального метода исследования:

получение изолированного роста

-накопление чистой культуры

окончательная идентификация чистой культуры

прогрев посевного материала

 

Третий этап культурального метода исследования:

получение изолированного роста

накопление чистой культуры

-окончательная идентификация чистой культуры

прогрев посевного материала

 

Предварительный этап культурального метода исследования:

получение изолированного роста

накопление чистой культуры

окончательная идентификация чистой культуры

-прогрев посевного материала

 

Предварительный этап культурального метода исследования применяется для выделения:

клебсиелл

кокков

энтеробактерий

-бацилл

-клостридий

 

На каком этапе культурального метода проводится прогрев посевного материала:

-на предварительном

на первом

на втором

на третьем

 

Дифференциально-диагностические среды (но не среды накопления и первичной дифференциации):

-Эндо

-Левина

-Плоскирева

Рассела

Клиглера

Олькеницкого

 

Среды накопления и первичной дифференциации:

Эндо

Левина

Плоскирева

-Рассела

-Клиглера

-Олькеницкого

 

Среды, на которых из биохимических признаков определяется лишь способность бактерий утилизировать лактозу:

-Эндо

-Левина

-Плоскирева

Рассела

Клиглера

Олькеницкого

 

Среды, на которых, кроме способности бактерий утилизировать лактозу, определяются и другие биохимические признаки:

Эндо

Левина

Плоскирева

-Рассела

-Клиглера

-Олькеницкого

 

Какая среда (какие среды) используется (используются) для изучения сахаролитической активности бактерий:

-среды Гисса

среда Китта-Тароцци

среда Вильсона-Блера

среда Цейсслера

желатин

 

Какая среда (какие среды) используется (используются) для выявления протеолитической активности бактерий:

среды Гисса

среда Китта-Тароцци

среда Вильсона-Блера

среда Цейсслера

-желатин

 

Какие среды при выделении энтеробактерий используются на первом этапе культурального метода:

-Эндо

-Левина

-Плоскирева

Рассела

Клиглера

Олькеницкого

Гисса

желатин

 

Какие среды при выделении энтеробактерий используются на втором этапе культурального метода:

Эндо

Левина

Плоскирева

-Рассела

-Клиглера

-Олькеницкого

Гисса

желатин

 

Какие среды при выделении энтеробактерий используются на третьем этапе культурального метода:

Эндо

Левина

Плоскирева

Рассела

Клиглера

Олькеницкого

-Гисса

-желатин

 

Бактериофаг:

-вирус, поражающий прокариотическую клетку

вирус, поражающий эукариотическую и прокариотическую клетку

особая бактерия, поражающая другие бактерии

 

Бактериофаг открыл:

-д’Эрелль

Пастер

Кох

Мечников

Левенгук

 

Структура бактериофага:

нуклеиновая кислота

-нуклеиновая кислота, окруженная белковой оболочкой

нуклеиновая кислота, окруженная клеточной мембраной

аналогична структуре бактериальной клетки

 

Бактериофаги, поражающие несколько видов бактерий:

-полифаги

монофаги

типовые фаги

 

Бактериофаги, поражающие один вид бактерий:

полифаги

-монофаги

типовые фаги

 

Бактериофаги, поражающие один вариант бактерий внутри вида:

полифаги

монофаги

-типовые фаги

 

Лизирует бактериальную клетку с выходом большого количества фаговых частиц:

-вирулентный фаг

умеренный фаг

дефектный фаг

 

Лизогенизирует бактериальную клетку:

вирулентный фаг

-умеренный фаг

дефектный фаг

 

Интегрируется в геном бактерии:

вирулентный фаг

-умеренный фаг

дефектный фаг

 

Полностью или частично заменять свой геном на участок генома бактериальной клетки – хозяина:

вирулентный фаг

умеренный фаг

-дефектный фаг

 

Методы титрования бактериофага:

метод Китта-Тароцци

-метод Грациа

-метод Аппельмана

метод Вильсона-Блера

метод Цейсслера