Размножение бактерий и принципы их культивирования. Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий.

ЛФ, ФИУ, ПФ. Занятие № 5

А. Основные положения

 

Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий.

В зависимости от способа создания безвоздушной среды, все методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делят на физические (например, использование анаэростата), химические (например, удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции) и биологические (совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма); особняком стоит метод Китта-Тароцци, сочетающий в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов: бактерии культивируются в пробирке с глюкозным МПБ, залитым маслом и с кусочками печени на дне.

 

Принципиальная схема культурального метода исследования.

Все виды бактерий выделяются и идентифицируются по единому алгоритму, состоящему из трех этапов: получение изолированного роста, накопление чистой культуры, окончательной идентификации чистой культуры; при выделении спороносных бактерий (бацилл и клостридий) проводится прогрев посевного материала на предварительном этапе для уничтожения вегетативных форм бактерий.

 

Культуральные признаки бактерий.

К культуральным признакам бактерий относятся питательные потребности, оптимальная питательная среда, температура культивирования, условия аэрации, скорость роста, характер роста на жидких и плотных питательных средах.

 

Приборы автоматической идентификации бактериальных культур и особенности работы с ними.

При использовании приборов автоматической идентификации бактериальных культур (например, как гемокультиватора BACTEC) врач-бактериолог освобождается от проведения многих однообразных и требующих больших временных затрат процедур, однако, и в этом случае принцип проведения культурального метода исследования полностью совпадает с изложенным в этом разделе, лишь второй и третий этапы осуществляются без участия человека – они практически полностью автоматизированы.

 

Изучение биохимических свойств бактерий (на примере энтеробактерий).

Биохимические свойства энтеробактерий начинают изучать одновременно с выделением культуры, засевая материал на дифференциально-диагностические питательные среды Эндо, Левина, Плоскирева (для определения способности бактерий утилизировать лактозу), после чего чистая культура накапливается на средах накопления и первичной дифференциации (Рассела, Клиглера, Олькеницкого), на которых, кроме утилизации лактозы, определяется способность бактерий утилизировать глюкозу, мочевину и продуцировать сероводород; на третьем этапе на средах Гисса оценивается сахаролитическая активность, а по способности разжижать желатин – протеолитическая активность; кроме того, на последнем этапе проводят пробы на наличие у идентифицируемой культуры отельных ферментов.

 

Определение термина «бактериофаг».

Бактериофаг – это вирус, поражающий бактериальную клетку.

 

Открытие бактериофага.

Бактериофаг открыл д’Эрелль.

 

Номенклатура бактериофага.

Номенклатура фагов основана на видовом наименовании хозяина.

 

Структура бактериофага.

Структура бактериофага может быть в принципе описана как нуклеиновая кислота, окруженная белковой оболочкой, как и у всех вирусов, в составе бактериофага может быть только один тип нуклеиновой кислоты – или ДНК или РНК.

Морфологические типы бактериофагов.

В зависимости от наличия и характера основных структурных компонентов – головки и отростка – бактериофаги подразделяются на морфологические типы, в пределах которых, в свою очередь, возможны различные варианты.

 

Классификации бактериофагов по спектру действия.

Бактериофаги, поражающие несколько видов бактерий, называются полифагами, один вид бактерий – монофагами (видовым фагами), один вариант бактерий внутри вида –типовыми фагами.

 

Классификация бактериофагов в зависимости от эффекта действия на бактериальную клетку.

По особенностям взаимодействия с чувствительной клеткой выделяют вирулентный (лизирует клетку с выходом большого количества фаговых частиц) и умеренный (внедряющийся в геном бактерии, т.е. лизогенизируя её) бактериофаги; кроме этого, бактериофаг может полностью или частично заменять свой геном на участок генома бактериальной клетки – хозяина: такие бактериофаги называются дефектными.

 

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой.

Фаг адсорбируется на поверхности бактерии, внутрь последней проникает лишь нуклеиновая кислота фага, которая взаимодействует с геномом бактериальной клетки, в результате чего клетка начинает продуцировать белки и нуклеиновые кислоты фага, после чего они собираются в фаговые частицы и выходят из клетки (в случае вирулентного фага – продуктивная инфекция) или нуклеиновая кислота фага интегрируется в ДНК бактерии, реплицируясь в её составе при каждом делении клетки (в случае умеренного фага – лизогенизация).

 

Практическое применение бактериофагов.

Фаги используются в диагностике (при идентификации выделенной бактерии), терапии (всегда местно, вводимы парентерально бактериофаг уничтожается вырабатываемыми против него антителами) и профилактике (применение per os, например, дизентерийного и брюшнотифозного бактериофагов).

 

Выделение бактериофага.

Материал, их которого выделяется бактериофаг (объект внешней среды или бактериальная культура), фильтруют через бактериальный фильтр, фильтрат помещают в жидкую питательную среду, куда засевают чувствительную к выделяемому фагу бактериальную культуру, после термостатирования проводят учет опыта: рост бактерии свидетельствует об отсутствии в исследуемом материале искомого бактериофага, отсутствие роста бактерий свидетельствует, что искомый бактериофаг в исследуемом материале присутствует.

 

Фагоиндикация.

Видовой фаг используется для идентификация вида бактерии: после засева идентифицируемой культуры газоном на чашку Петри на её поверхность капается видовой бактериофаг – если в месте нанесения капли роста бактерии не наблюдается, то бактерия относится к данному виду.

 

Методы титрования фага.

Титрование (т.е. определение его количества в исследуемом материале) бактериофага производят или на жидкой среде (метод Аппельмана) или на плотной среде (метод Грациа).

 

Фаготипирование бактерий.

Типируемый штамм засевают газоном на пластинчатый агар, затем на засеянную поверхность капают капли типовых бактериофагов, чашку с посевом инкубируют в термостате и учитывают опыт, регистрируя «стерильные пятна» или «бляшки» – места отсутствия роста в месте нанесения капли бактериофага, к которому чувствителен данный вариант бактериального вида.

 

 

Б. Лекционный курс

В. Теоретический материал

8. Размножение бактерий и принципы их культивирования
8.7. Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий
9. Культуральный метод исследования
9.1. Принципиальная схема культурального метода исследования
9.2. Культуральные признаки бактерий
9.3. Изучение биохимических свойств бактерий (на примере энтеробактерий)
10. Бактериофаги
10.1. Открытие, номенклатура и структура бактериофагов
10.2. Морфологические типы бактериофагов
10.3. Классификация бактериофагов по спектру действия
10.4. Вирулентный, умеренный, дефектный бактериофаги
10.5. Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой 10.6. Практическое применение фагов
10.7. Выделение и титрование бактериофага

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ И ПРИНЦИПЫ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

8.7. Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий

В зависимости от способа создания безвоздушной среды, все методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делят на физические, химические и биологические. Особняком стоит метод Китта-Тароцци, сочетающий в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов.

А. Воздух, точнее кислород воздуха, можно удалить из среды культивирования бактерий физическими методами.

1. Можно использовать анаэростат – сосуд с герметической крышкой, из которого отсасывают воздух насосом. В такой сосуд помещают чашки Петри с посевами и после откачивания воздуха ставят (если он по своим размерам позволяет это сделать – такие небольшие анаэростаты называются микроанаэростатами) в термостат, где происходит культивирование бактерий.

2. Существуют, по сути, разновидности анаэростатов, в которых удаленный воздух замещается каким-нибудь инертным газом, например – в аппарате Кипа – водородом.

3. Один из наиболее распространенных способов создания анаэробных условий при культивировании бактерий используется в так называемых трубках Виньяль-Вийона. Этот метод прост в осуществлении и не требует какой-либо особой аппаратуры. В трубках Виньяль-Вийона осуществляется глубинное культивирование бактерий. Для этого бактериальная культура разводится в расплавленной и охлажденной питательной среде (в пробирках или пипетках – отсюда и название «трубки») с таким расчетом, чтобы бактериальные клетки находились на значительном удалении одна от другой. При застывании питательной среды бактериальные клетки оказываются «замурованными» в ее толще и при культивировании каждая из них формирует отдельную колонию (естественно, без доступа кислорода воздуха).

4. Анаэробные условия для культивирования бактерии создадются и в случае их засева уколом в высокий столбик полужидкого агара. Место укола тут же затягивается и бактерии растут в толще питательной среды.

5. Удалить воздух, растворенный в жидкой питательной среде, можно с помощью кипячения. При нагревании жидкости растворенный в ней воздух выходит в атмосферу, что мы и наблюдаем в виде «бурления». Такой процесс называется регенерацией питательной среды. Чтобы впоследствии при медленном охлаждении воздух вновь не растворился в питательном бульоне, его охлаждают очень быстро (например, под струей холодной воды).

6. Чтобы свести к минимуму диффузию атмосферного воздуха в питательную среду, ее поверхность покрывают слоем жидкого масла (например, вазелинового). В этом случае говорят о «культивировании под слоем масла».

7. При глубинном культивировании бывает трудно получить доступ к нужной колонии и извлечь ее из толщи питательной среды. Облегчает эту задачу метод Перетца: в чашку Петри заливается расплавленная и охлажденная питательная агаризованная среда, смешанная с бактериальной культурой, на поверхность которой осторожно помещается предметное стекло, которое слегка вдавливают в питательный агар. Те колонии, которые вырастают непосредственно под этим стеклом, после снятия последнего становятся легко доступными.

Б. Химические методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий делятся на две группы.

1. Для связывания кислорода воздуха можно провести в замкнутом объеме (например, в эксикаторе с притертой крышкой) химическую реакцию, которая протекает с поглощением воздуха.

а. В методе Аристовского с этой целью используются сыпучие ингредиенты. В развитие этого метода современная микробиологическая промышленность выпускает специальные наборы, с помощью которых можно создать газовую смесь, как с полным отсутствием кислорода, так и с присутствием его, а также углекислого газа и азота, в определенных концентрациях, необходимых для культивирования бактерий с «нестандартными» требованиями к условиям аэрации.

б. В методе Омелянского с этой целью используются жидкие ингредиенты (пирогаллол и едкое кали).

2. Можно добавить в жидкую питательную среду вещества, связывающие кислород. Такие вещества называются редуцирующими. К ним относится, например, глюкоза, тиогликолевая кислота и ряд других.

В. В качестве биологического метода создания анаэробных условий для культивирования бактерий наиболее распространен (в различных модификациях) метод Фортнера. Принцип его состоит в том, что в замкнутом объеме (например, в парафинированной чашке Петри) одновременно культивируются анаэробы и так называемый «жадный аэроб» – вид бактерий, усиленно поглощающий при своем росте кислород. В качестве последнего наиболее часто используется энтеробактерия Serracia marcescens. Аэроб уничтожает весь кислород замкнутого объема, создавая тем самым условия для роста анаэроба.

Г. Метод Китта-Тароцци заключается в использовании для культивирования анаэробов одноименной питательной среды. Среда Китта-Тароцци состоит из мясопептонного бульона, содержащего глюкозу (в качестве редуцирующего вещества), регенерированного и залитого слоем масла, на дно пробирки помещают кусочки паренхиматозного органа (чаще – печени) для адсорбции растворенного в мясопептонном бульоне воздуха.