Оценка, культивирование и хранение зародышей

Специальные исследования свиде­тельствуют, что частота отклонений от нормы у яйцеклеток, выделившихся во время суперовуляции, более высокая, чем при овуляции у животных без гор­мональных обработок. Поэтому после суперовуляции оплодотворяются не все яйцеклетки, а из оплодотворившихся яйцеклеток не всегда развиваются пол­ноценные зародыши, пригодные к пере­садке. В связи с этим для достижения высоких результатов отбирают зароды­шей, способных к дальнейшему разви­тию в организме реципиента. Наиболее широкое распространение получили способы оценки качества и жизнеспо­собности зародышей по морфологичес­ким признакам и по результатам их культивирования.

Морфологическую оценку зароды­шей проводят с использованием инвер­тированного микроскопа МБИ-13. При этом учитывают соответствие стадии развития зародыша его возрасту, целос­тность и форму прозрачной оболочки, равномерность дробления бластомеров и состояние их цитоплазмы, величину и прозрачность перивителлинового про­странства. Зародыши с признаками де­генерации, уродств и недоразвития для пересадок непригодны. (Подробно ме­тодика изложена в «Практикуме по аку­
шерству, гинекологии и искусственно­му осеменению сельскохозяйственных животных».)

После морфологической оценки за­родышей до пересадки можно кратко­временно хранить в термостате при тем­пературе 37 "С. При этом их помещают на часовое стекло в 0,5 мл среды Дюль- бекко с добавлением 20 % фетальной сыворотки теленка или сыворотки овцы. Часовые стекла с зародышами ставят в чашки Петри, на дно которых кладут увлажненную фильтровальную бумагу. Таким образом сохраняется жизнеспособность зародышей и обеспе­чивается возможность более точного выявления их полноценности.

Для замораживания зародышей го­товят среду из следующих компонен­тов (в г/л): натрия хлорид 8,0; калия хлорид 0,2; гидроортофосфат (динат- рийфосфат) безводный 1,15; дигидро- ортофосфат (монокалийфосфат) одно- замещенный 0,2; магния хлорид, со­держащий 6 молекул воды, 0,1; калия хлорид безводный 0,1; натрия пируват 0,076; глюкоза 1,0. В этот раствор до­бавляют 20 % фетальной сыворотки крови теленка и 100 тыс. ЕД/л пени­циллина (калиевой соли). Среду гото­вят в стерильных условиях в день при­менения. Часть среды используют для приготовления рабочего раствора (к 8 мл среды добавляют 1000 ЕД пени­циллина и 2 мл фетальной сыворотки). Затем готовят серию растворов с раз­ной концентрацией глицерина по ме­тодике, изложенной в инструкции, и насыщают зародыш глицерином од­но- или многоступенчатым способом. Этот процесс контролируют под мик­роскопом в стерильных условиях при температуре 20 "С, после чего зароды­ши сразу замораживают в стеклянных пробирках или ампулах, пластиковых соломинках, которые маркируют.

Охлаждение проводят в несколько этапов: 1) снижают температуру от 20 "С до минус 5—7 °С со скоростью 1—10 °Св 1 мин; 2) при минус 6—7 "С проводят ис­кусственную кристаллизацию, касаясь пинцетом, переохлажденным в жидком азоте, поверхности контейнера с заро­дышами; 3) продолжают охлаждать со скоростью 0,3 °С в 1 мин до минус 36 °С; 4) погружают в жидкий азот для быстро­го охлаждения до минус 196 °С. Хранят замороженные эмбрионы в сосудах Дьюара. Для оттаивания емкости с заро­дышами быстро переносят в водяную баню с температурой 25—37 °С и держат до исчезновения льда.

Вместе с раствором криопротектора эмбрион помещают на часовое стекло, предварительно оценивают под лупой и удаляют криопротектор, помещая заро­дыш в заранее приготовленные раство­ры глицерина убывающей концентра­ции. Затем еще раз оценивают качество зародышей под микроскопом. Когда эм­брионов замораживают в соломинках с раствором глицерина и сахарозы, то после оттаивания соломинку несколько раз встряхивают (подобно термометру). При этом пробка, закрывающая соло­минку, должна быть направлена вверх. Для уравновешивания осмотического давления и удаления криопротектора из зародыша соломинку помещают верти­кально (пыжом вверх) в водяную баню с температурой 25—37 °С. Затем присту­пают к пересадке эмбриона (Н. И. Сер­геев, С. А. Мазепкин).

Разработаны и другие способы куль­тивирования зародышей вне организма, позволяющие сохранять их жизнеспо­собность до 24—48 ч. Зародышей можно культивировать в пробирках, а также в ампулах и пайетах из поливинилхлори- да. До 4—7 дней сохранить их можно в перевязанном яйцепроводе кролика. Однако наиболее перспективным мето­дом является глубокое замораживание зародышей в жидком азоте при темпера­туре минус 196 °С. Зародыши крупного рогатого скота лучше других переносят замораживание и размораживание; вы­живаемость — 50—70 %.

Реципиент — животное, которому трансплантируют (пересаживают) в матку одного или двух зародышей на ранней стадии их развития. После пе­ресадки в организме реципиента долж­ны быть обеспечены оптимальные ус­ловия для дальнейшего развития заро­дыша и рождения жизнеспособного плода. Реципиентов отбирают в коли­честве 6—8 гол. на каждого донора из числа животных, не имеющих большой племенной ценности. При этом ис­пользуют телок в возрасте 16—18 мес с массой 350—380 кг или коров не старше 7 лет. Животные должны быть здоровы­ми, без признаков нарушения обмена веществ. Успех пересадок в значитель­ной степени зависит от физиологичес­ки полноценного течения половых циклов и правильного определения охоты у реципиентов. Необходимо тщательно контролировать течение последних двух половых циклов и все дальнейшие показатели регистриро­вать в соответствующей документации (календарь полового цикла). Половые циклы должны протекать регулярно, быть полноценными, с синхронным формированием стадии возбуждения. Животных с нерегулярными, неполно­ценными половыми циклами, с ненор­мальной продолжительностью отдель­ных феноменов стадии возбуждения полового цикла исключают из числа ре­ципиентов. Реципиенты должны быть в состоянии средней упитанности, с хо­рошим физическим развитием, иметь крупный, правильной формы таз. Яич­ники и матка должны быть нормально развиты, без патологических измене­ний.

Отобранных реципиентов еще раз обязательно обследуют перед транс­плантацией зародышей. Яичники долж­ны быть типичными для соответствую­щей стадии полового цикла, без кист. Уточняют степень развития и положе­ние желтого тела.