При оценке состояния мужской репродуктивной системы используются как традиционные клинические методы исследований, так и методы, основанные на применении новых современных технологий, включая молекулярно-биологические и генетические [74, 94–98].
В целях повышения качества исследований мужской репродуктивной системы внедряются современные технологии, позволяющие в большей степени объективизировать результаты анализа. Выпускается ряд моделей автоматических спермоанализаторов, с помощью которых можно определить в сперме не менее 9 параметров, в том числе количество сперматозоидов, их подвижность, морфологию клеток, фрагментацию ДНК и т. д. Среди них спермоанализатор АФС-500 и АФС-500-2 фирмы «Биола» (РФ), спермоанализатор SQA-V фирмы «МЕS» (Израиль), анализатор качества спермы Microptic SCA (Испания), система NOS Sperm Analyzer фирмы «Hamilton Thorne Inc» (США) [99]. Для оценки подвижности клеток спермы разработана компьютерная система анализа семенной жидкости САSА (Соmputer assisted semen analysis).
Общепринятым интегральным критерием состояния репродуктивной системы у мужчин является исследование эякулята (спермы), позволяющее установить фертильность и выявить возможные заболевания этой системы.
Клинические методы, используемые при исследовании спермы, в основном унифицированы и проводятся в соответствии с рекомендациями ВОЗ, которые устанавливают общепризнанные нормы фертильного эякулята [100]. С течением времени эти нормы корректируются в связи с выраженной тенденцией к постепенному падению показателей спермограммы [101]. Последние изменения в референсных значениях показателей эякулята ВОЗ утвердила в 2010 г. [100]. Нормы ВОЗ некоторых важнейших показателей спермограммы приведены в табл. 2.1.
Таблица 2.1. Нормативные показатели фертильного эякулята, рекомендованные ВОЗ (нижняя граница референсных значений семенных параметров) [95, 100]
Исследование спермы носит комплексный характер и включает оценку ее физических свойств, микроскопический и биохимический анализ. Физические свойства спермы характеризуют такие показатели, как объем (количество), цвет, мутность, запах, время разжижения, вязкость, pH. В ходе микроскопического исследования спермы анализируются свойства ее клеточных элементов, при этом определяют количество сперматозоидов, их подвижность, жизнеспособность и морфологию клеток. Биохимическое исследование спермы направлено на анализ таких показателей, которые определяют функциональное состояние яичек (семенников) и дополнительных половых желез, имеющих решающее значение при диагностике бесплодия и иных заболеваний.
Среднее количество спермы в норме у человека составляет 3,5 мл, которая имеет слабощелочную реакцию (рН 7,2–7, 8). Сперматозоиды, которые продуцируются яичками, составляют около 5 % объема спермы. Приблизительно 60 % объема спермы образуется в семенных пузырьках, менее 10–15 % – в придатках яичка (семенниках), других добавочных железах и семявыносящих протоках.
Общее количество сперматозоидов в сперме в норме у мужчин – 40–60 млн/мл и более, при минимальной концентрации их в 1 мл 15 млн. Различают олигозооспермию, когда концентрация сперматозоидов ниже нормативного значения, и азооспермию, если сперматозоиды в эякуляте отсутствуют.
В соответствии с последними нормами ВОЗ [100] (2010 г.) подвижность сперматозоидов принято классифицировать на следующие три группы: сперматозоиды с прогрессивным и непрогрессивным движением и неподвижные. Однако в литературе можно встретить данные о сперматозоидах, подвижность которых характеризуется как быстрое прогрессивное движение (а), медленное линейное и нелинейное прогрессивное движение (b), колебательное или движение на месте (с) и неподвижные клетки (d). В нормальной фертильной сперме число сперматозоидов с прогрессивным движением должно составлять не менее 32 %. Если подвижность сперматозоидов ниже нормативного значения, то это указывает на астенозооспермию.
Выявление «живых» или «мертвых» сперматозоидов основано на способности клеток поглощать различные красители, например эозин-нигрозин. Мертвые клетки с поврежденными мембранами накапливают этот краситель, в то время как в живые клетки он не проникает. В норме в мазке определяется 70–80 неокрашенных (живых) клеток; нижняя граница количества жизнеспособных сперматозоидов составляет 58 %.
Для отбора жизнеспособных сперматозоидов (например, в методе ИКСИ – интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида – от англ. ICSI–Intra Cytoplasmic Sperm Injection) может быть использован также тест на гипоосмотическое набухание. Он основан на том, что у жизнеспособных сперматозоидов мембраны интактны. Обычно он применяется для оценки жизнеспособности неподвижных зрелых половых клеток. Добавление в среду гипоосмотического раствора ведет к набуханию цитоплазмы и закручиванию хвостов сперматозоидов. Сперматозоиды с поврежденными мембранами не набухают, так как не могут поддерживать осмотический градиент [102, 103]. Результат этого теста считается нормальным, когда не менее чем у 60 % сперматозоидов произошло набухание и закручивание хвостов.
При анализе морфологии клеток учитываются количество нормальных сперматозоидов, сперматозоидов с нормальной морфологией головки, с дефектами головки, его средней части, хвоста, наличием клеток на различных стадиях дифференцировки и т. д. В норме сперматозоиды имеют овальную головку, акросома которой обычно составляет треть ее поверхности. Высокое процентное содержание сперматозоидов с морфологическими аномалиями головки, среднего сегмента и хвоста свидетельствует 0 тератозооспермии.
Принято рассчитывать индексы спермальных нарушений (SDI) и тератозооспермии (TZI). SDI – среднее количество патологий на 1 сперматозоид, а TZI – среднее количество патологий на 1 аномальный сперматозоид, или так называемый индекс тератозооспермии. При превышении TZI значения 1,6 сперма считается аномальной, а при превышении индекса SDI значения 1,6 могут возникнуть проблемы даже при искусственном оплодотворении [95].
Наиболее часто исследуемые биохимические показатели спермы – содержание фруктозы, цинка, лимонной кислоты, L-карнитина, активность альфа-глюкозидазы, креатинфосфокиназы, γ-глутамилтрансферазы. Эти параметры преимущественно отражают функциональную активность добавочных желез.
Фруктоза, продуцируемая в семенных пузырьках, – основной углевод, который содержится в сперме. Нормальное содержание ее в сперме здорового мужчины 13–15 ммоль/л [74]. Уменьшение уровня фруктозы в сперме коррелирует с недостатком андрогенов, а также низкой продукцией ее в семенных пузырьках.
Содержание цинка и лимонной кислоты в сперме отражает секреторную способность предстательной железы. На функциональную активность простаты указывает активность γ-глутамилтранспептидазы в семенной жидкости, так как основная секреция этого фермента происходит в этом органе.
Для оценки патологических изменений в эпидидимисе используется определение концентрации L-карнитина, активности α-глюкозидазы и содержания глицерилфосфорилхолина. Например, уровень L-карнитина возрастает в процессе созревания сперматозоидов. Выявлена зависимость содержания L-карнитина с подвижностью сперматозоидов, она уменьшается с падением уровня этого показателя [104].
Для функциональной оценки клеток Сертоли анализируют содержание ингибина, активина и андрогенсвязывающего белка, которые вырабатываются указанными клетками.
Содержание аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и активность креатинфосфокиназы (КФК), определяемые в сперматозоидах, указывают на уровень их энергообеспечения. КФК – фермент, участвующий в энергетическом обмене сперматозоидов. Повышенные уровни активности КФК связаны с увеличением частоты функциональных нарушений сперматозоидов и увеличением объема их цитоплазмы. Кроме того, активность КФК коррелирует с количеством зрелых половых клеток и с их способностью к оплодотворению. Однако между активностью этого фермента и подвижностью сперматозоидов связи не выявляется [105].
В последнее время большое внимание уделяется оценке состояния свободнорадикальных процессов в сперматозоидах. Повышенное количество АФК могут вызвать окислительный стресс и привести к дестабилизации мембран и нарушению целостности ДНК в половых клетках. Считается, что окислительный стресс является основной причиной нарушения функции сперматозоидов. В чрезмерных количествах АФК препятствуют нормальному функционированию сперматозоида, индуцируя пероксидазное повреждение его цитоплазматической мембраны и нарушая мембранно-зависимые процессы, такие, как подвижность, акросомный экзоцитоз и слияние с цитолеммой яйцеклетки. Сперматозоиды особенно восприимчивы к окислительному стрессу из-за высокого содержания полинасыщенных жирных кислот и ограниченных возможностей антиоксидантной защиты.
Анализ уровней АФК, NO', продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов, шиффовых оснований, малонового диальдегида (МДА)), активности антиоксидантных ферментов (например, глютатионпероксидазы, супероксиддисмутазы (СОД), каталазы) и уровня антиоксидантов, некоторых белков в сперматозоидах или в тестикулярной ткани позволяет сделать вывод о возможности развития окислительного стресса после действия ЭМП в диапазоне мобильной связи [106–109].
Пригодность параметров традиционного анализа спермы как предиктора фертильности до настоящего времени ограничена. Поэтому сейчас развиваются альтернативные тесты, основывающиеся преимущественно на функциональных аспектах: пенетрация спермы, капацитация, акросомальная реакция [94]. Разработан ряд тестов, позволяющих оценить взаимодействие сперматозоидов с яйцеклеткой. Среди них – связывание сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита, пенетрация сперматозоидов яйцеклетки золотистого хомячка, акросомная реакция.
Тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита может быть полезным инструментом для выявления основных нарушений взаимодействия сперматозоида с яйцеклеткой [110]. Для проверки возможности связывания сперматозоида с неоплодотворенной яйцеклеткой используется сперма фертильного донора. После инкубации ооциты отмывают в культуральной среде и оценивают количество сперматозоидов, проникших через блестящую оболочку и перивителлиновое пространство. Окончательный результат выражается индексом пенетрации (НZI), его значение считается нормальным, если оно выше или равно 35 %.
С помощью теста на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка определяется способность спермы пациента к капацитации и способность капацитированных сперматозоидов к акросомной реакции и слиянию с желточной оболочкой яйцеклетки. Яйцеклетки хомячка без блестящей оболочки инкубируют со спермой пациента, подготовленной стандартными методами. Результаты выражаются количеством ооцитов, в которые проникли сперматозоиды; число 5 считается нормальным.
Изучение показателей акросомной реакции позволяет оценить эффективность процесса проникновения сперматозоида в яйцеклетку. Акрозин (протеаза) выявляется в активных сперматозоидах, а в неактивных он присутствует в форме проакрозина. В сперматозоидах мужчин с бесплодием концентрация акрозина существенно снижается по сравнению с нормой. Акросомная реакция запускается при контакте сперматозоида с блестящей оболочкой (zona pellucida) и представляет собой экзоцитоз содержимого акросомы. Протеолитические ферменты, высвобождаемые из акросомы, облегчают как проникновение через блестящую оболочку, так и изменение поверхности сперматозоида перед слиянием с яйцеклеткой. Этот тест может быть полезен при наличии у сперматозоидов серьезных отклонений в морфологии головки или при бесплодии неясной этиологии [111].
Одним из наиболее перспективных направлений в исследовании мужской репродуктивной функции является изучение аномалий структурной организации хроматина мужских гамет, которые могут быть обусловлены эндогенными разрывами молекулы ДНК в процессе компактизации хроматина ядер сперматозоидов, инициацией процесса апоптоза в ходе сперматогенеза, окислительным стрессом в результате действия избыточной концентрации активных форм кислорода. Структурный анализ хроматина спермы обеспечивает идентификацию ДНК как одного из важнейших параметров качества спермы [112–114]. Методы исследования фрагментации ДНК позволяют оценить степень повреждения молекулы этого биополимера в сперматозоидах. Она включает двухцепочечные и одноцепочечные разрывы молекулы ДНК [114, 115].
Для оценки повреждений ДНК в сперматозоидах используются метод SCSA (англ. – sperm chromatin structure assay), TUNEL (англ. – terminal deoxynucleotidyl transferases (TdT) dUTP end labeling) и электрофоретические методы.
Метод SCSA является одним из наиболее распространенных и объективных методов иследования повреждения ДНК [115]. Тест основан на метахроматических свойствах акридинового оранжевого, который изменяет флюоресценцию от зеленого до красного в зависимости от того, с одноцепочечной или двухцепочечной молекулой ДНК он связан. Акридиновый оранжевый, связанный с двухцепочечной ДНК, проявляет зеленую флюоресценцию, а связанный с одноцепочечной – красную. Метод адаптирован к проточной цитометрии и в таком виде нашел широкое использование в научных исследованиях и в практике репродуктивных центров [116].
С использованием метода SCSA измеряется процент сперматозоидов с высокой чувствительностью к рН-индуцированной денатурации, который обозначается как индекс фрагментации ДНК – DFI (DNA fragmentation index, %). Этот параметр отражает уровень разрывов в ДНК. Кроме DFI, SCSA позволяет идентифицировать процент сперматозоидов с незрелым ядром, имеющим аномальную структуру хроматина. Этот показатель обозначается как HDS (high level of DNA stainability, %). DFI < 30 % классифицируется как низкий уровень фрагментации ДНК, DFIі30 % – высокий уровень. HDS < 15 % – низкое содержание незрелых сперматозоидов, HDSі15 % – высокий уровень незрелых сперматозоидов [117].
Метод TUNEL служит методом прямого мечения разрывов в ДНК. Интенсивность люминесценции пропорциональна числу встроенных dUTP и соответственно числу разрывов в ДНК. В качестве флуорохрома обычно используется флюоресцеин. Используется расчет процента TUNEL-позитивных клеток. Применяются модификации метода, например, с использованием антифлюоресцеиновых антител. Метод требует малого числа сперматозоидов.
С помощью электрофоретических методов можно идентифицировать высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции ДНК [117]. В норме для ДНК характерна высокомолекулярная форма. Однако в ходе апоптоза в соматических клетках ДНК подвергается эндонуклеазному межнуклеосомному расщеплению на фрагменты (до 180–200 н.п.), что выявляется электрофоретически в образцах выделенной из клеток ДНК с окрашиванием бромида этидием.
Электрофорез на единичных клетках, получивший название «Comet Assay», позволяет определить содержание высоко– и низкомолекулярной ДНК по ареалу низкомолекулярной ДНК, напоминающей хвост кометы, получаемый при мини-электрофорезе клеток, иммобилизованных в агарозном геле. Для этого применяется специфическая обработка клеток с использованием протеиназы К. Результатом служит число клеток с «кометным хвостом» относительно общего числа клеток. Также измеряется длина хвоста [118].
Проведены специальные исследования, посвященные сопоставлению различных методов оценки целостности ДНК в сперматозоидах. Показано, что результаты Сomet-анализа коррелируют с результатами TUNEL и SCSA [119]. Нормальные результаты анализа на определение целостности хроматина сперматозоидов находятся в диапазоне от ≤ 60 % до ≤ 73 %.
Одним из признаков повреждения ДНК в сперматозоидах является также появление особой окисленной формы – 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-OH-ДГ), образующейся под влиянием избыточных активных форм кислорода [120]. 8-ОН-ДГ является метаболическим побочным продуктом оксидативного повреждения гуаниновых оснований ДНК, имеющих самый низкий из всех четырех оснований оксидативный потенциал [121–122]. Гидроксилирование гуанозина происходит и в результате нормальных метаболических процессов, и под действием различных факторов окружающей среды. Он является биомаркером оксидативного стресса и потенциальным маркером канцерогенеза. Оценка его содержания в тканях коррелирует со степенью повреждения и репарации ДНК. 8-ОН-ДГ является стабильным продуктом, не подвергающимся дальнейшему метаболизму [122–124]. Для его определения в биологическом материале у человека и животных используются методы иммуноферментного анализа.
Причинами разрывов ДНК в сперматозоидах считают процессы изменения структуры хроматина в ходе сперматогенеза и апоптоза (программированная гибель клетки). Поэтому исследование маркеров программированной гибели важно для оценки состояния эпидидимальных сперматозоидов и тестикулярных сперматогенных клеток.
Самый распространенный апоптотический маркер – аннексин, являющийся кальцийзависимым белком, обладающим высокой аффинностью к фосфатидилсерину. Аннексин, связанный с каким-либо флюоресцентным красителем, позволяет детектировать транслокацию фосфатидилсерина на внешнюю сторону плазматической мембраны (экстернализацию) при апоптозе [125, 126]. Присутствие аннексина служит ранним признаком апоптоза. Апоптотическими являются около 20 % эякуляторных сперматозоидов по оценкам, полученным путем определения с помощью аннексина [127].
Определение наличия апоптотических маркеров в популяции сперматозоидов предполагает использование дополнительных красителей, позволяющих детектировать живые и некротические клетки. Некротические клетки определяют с помощью пропидиума йодида, который проникает только в погибшие клетки через поврежденную при некрозе мембрану. Зная число окрашенных апоптотических и некротических клеток, можно рассчитать апоптотический индекс: соотношение апоптотических и живых сперматозоидов [125, 126].
Исследования, в которых производился анализ с использованием аннексина и методов детекции разрывов в ДНК, таких, например, как TUNEL, доказывают наличие корреляции экстернализации фосфатидилсерина и разрывов в ДНК в сперматозоидах [125].
Для исследования одного из ключевых событий при апоптозе – деполяризации митохондриальной мембраны – могут быть использованы различные флюоресцентные красители, чувствительные к мембранному потенциалу митохондрий. Rhodamine 123, carbocyanin DiOC2, DilC1 используются в качестве зондов, поскольку аккумулируются в митохондриях. Исследованию изменения митохондриального потенциала (Dym), вовлеченного в апоптоз в сперматозоидах, посвящено немного исследований. По данным [128], сперматозоиды с высоким уровнем митохондриального потенциала имели низкий уровень фрагментации ДНК.
В соматических клетках конденсированный хроматин апоптотических клеток определяют с помощью флюоресцентного красителя Hoescht 33342, который в апоптотических клетках ярче, чем в живых. Исследование апоптоза в сперматозоидах с помощью такого метода несколько затруднено из-за того, что упаковка хроматина в них и так достаточно плотная.
Одно из ключевых событий при апоптозе – повреждение митохондрий с повышением проницаемости митохондриальных мембран. Митохондрии содержат проапоптотические и антиапоптотические белки, высвобождение которых в цитоплазму клетки приводит к реализации апоптоза или ингибирует его. Определение уровня таких белков, в частности семейства Bcl, применяется для исследования инициации апоптотического состояния клеток [129].
Характерной чертой апоптоза является увеличение активности каспаз. Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты [130]. Каспазы образуются за счет активации прокаспаз. У млекопитающих идентифицировано 13 каспаз. Часть из них в апоптозе не участвует. Каспазы, которые участвуют в апоптозе, разделяют на инициаторные (–2, –8, –9, –10, –12) и эффекторные (–3, –6, –7). Одна из основных функций эффекторных каспаз заключается в прямом и опосредованном разрушении клеточных структур, а также инактивации белков, блокирующих апоптоз. Их активность определяют главным образом с помощью иммуннофлюоресцентного метода [129, 131].
Эндокринологическое исследование – важная составная часть оценки состояния мужской репродуктивной системы и ее функционирования. Оно включает, прежде всего, определение содержания тестостерона, его предшественников и продуктов распада, гонадотропинов, эстрадиола, прогестерона и пролактина. Определение содержания гормонов в крови (сыворотке или плазме), а также и в моче широко используется при оценке репродуктивной функции у мужчин, при этом на первом месте стоит нарушение гормональной регуляции.
Уровень тестостерона в течение суток существенно колеблется, достигая максимума в утреннее время и снижаясь к вечеру. У взрослого мужчины средние значения этого гормона составляют 8,72–38,17 нмоль/л. Физиологически активен лишь свободный гормон. Поэтому определяют содержание общего тестостерона, который включает в себе содержание свободного тестостерона и тестостерона, связанного с альбумином и сте-роидсвязанным глобулином [98]. Низкий уровень тестостерона может свидетельствовать о недостаточной половой активности индивидуума или недоразвития половых органов. Значимое снижение уровня тестостерона и дигидротестостерона обнаружено в семенной жидкости у мужчин с азооспермией. Установлена положительная корреляция между концентрацией тестостерона и подвижностью сперматозоидов.
Концентрация дигидротестостерона не имеет прогностического значения для оценки бесплодия и сексуальной дисфункции у самцов, но определение соотношения тестостерон/дигидротестостерон важно для диагностики недостаточности 5α-редуктазы.
Биологическое значение определения эстрогенов у мужчин заключается в основном в стимулирующем влиянии их на интерстициальные клетки яичек. Прямой анализ уровня эстрадиола служит показателем состояния функции яичек. Содержание эстрадиола у мужчин составляет 10–50 пг/мл.
Основную массу пролактина продуцируют семенные пузырьки, что отражает функцию этих желез, хотя простата также может быть источником этого гормона. Его содержание в крови составляет 109–557 мЕд/мл.
Изучение репродуктивного статуса самцов у животных дает возможность использовать методы, позволяющие в полном объеме оценить функционирование этой системы, включая и те из них, которые широко используются в клинической практике.
Одним из показателей функционального состояния семенников, других органов репродуктивной системы самцов (эпидидимис, простата, семенные пузырьки) является их масса, в том числе весовые индексы (относительная масса органов). Высокая чувствительность сперматогенных клеток к различным воздействиям отражается на абсолютной и относительной массе семенников и эпидидимисов и, в меньшей степени, влияет на таковые в отношении семенных пузырьков и простаты.
Наиболее важным методом при оценке состояния репродуктивной системы самцов является гистологический анализ семенников. Исследование препаратов этого органа, окрашенных гемотоксилином и эозином, позволяет производить количественный анализ сперматогенных клеток различных стадий дифференцировки – сперматогоний, сперматоцитов 1-го и 2-го порядков, сперматид различных стадий дифференцировки и сперматозоидов, клеток Лейдига и Сертоли, рассчитывать диаметр и площадь поперечного сечения извитых семенных канальцев, индекс сперматогенеза и ряд других показателей. Гистологический анализ срезов яичек также в отдельных случаях применяется и в клинической практике, однако современная техника биопсии не позволяет широко использовать этот метод.
Внедрение методов ДНК-проточной цитометрии дает возможность количественно оценить количественный и качественный состав сперматогенных клеток в тестикулярной ткани. Основываясь на соответствующей интенсивности флюоросценции содержания ДНК (С) для гаплоидных, диплоидных и тетраплоидных клеток, клеточные популяции сперматогенных клеток классифицируют как сперматогонии (2С), сперматоциты на стадии прелептотены (S-фаза), сперматоциты 1-го порядка (4С), круглые сперматиды (1С), удлиненные сперматиды (НС1) и продолговатые сперматиды (НС2) [132].
Таким образом, разработанные к настоящему времени методы исследования мужской репродуктивной системы, используемые в экспериментальных и клинических исследованиях, дают возможность получить достаточно глубокое представление о ее функционировании в норме и при возможных нарушениях.
Глава 3
