Методы обнаружения антител в сыворотке крови животных или человека получили название серологических реакций (реакций иммунитета), характеризующихся большой чувствительностью и специфичностью.
К серологическим реакциям относятся: реакции агглютинации (РА), реакции преципитации (РП), реакция флокуляции (РФ), реакция нейтрализации (РН), реакция Кумбса, реакция связывания комплемента (РСК).
Обнаружение в сыворотке крови или других жидкостях организма специфических антител к определенному патогенному микробу говорит о развивающейся или перенесенной инфекции. Поэтому серологические реакции широко используют в диагностике многих болезней животных.
Суть серологической реакции заключается во взаимодействии антигена и антитела в среде электролита, например растворе хлорида натрия. С помощью известного антигена обнаруживают специфические антитела в организме больного животного, а с помощью известной сыворотки - антиген.
Это - проявление взаимодействия между антигеном и антителом. В зависимости от характера проявления такого взаимодействия антитела разделяют на коагулирующие (агглютинины, преципитины), лизирующие (бактериолизины, гемолизины), нейтрализующие (антитоксины, вируснейтрализующие антитела).
Посредством серологических реакций выявляют бактерионосительство, устанавливают бессимптомный инфекционный процесс, определяют родовую, видовую и типовую принадлежность возбудителя, эффективность вакцинации и т.д.
Агглютинины и реакция агглютинации
Агглютинины — антитела, способные склеивать в видимые простым глазом комочки (кучки) многих микробов - возбудителей инфекционных болезней.
Для выявления этих антител ставят реакцию агглютинации (РА). РА проста и специфична. Ее широко используют для диагностики бруцеллеза, лептоспирозов, сальмонеллезов. С помощью РА можно определить и вид выделенного неизвестного микроорганизма. В таких случаях РА ставят с известной агглютинирующей сывороткой. Необходимо учитывать, что сыворотки крови здоровых животных в малых разведениях тоже могут агглютинировать микробные клетки, поэтому реакцию считают положительной лишь при наличии агглютинации в определенных разведениях сыворотки, в которых действие «нормальных» антител уже не проявляется.
Реакция гемагглютинации (РГА) основана на склеивании взвешенных в жидкости эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий и некоторых других агентов. Ее применяют для быстрого выявления в крови вирусов гриппа, ринопневмонии лошадей.
Реакция задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА или РТГА) базируется на способности противовирусных антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вируса. Она позволяет выявлять в крови животных антитела к возбудителям гриппа лошадей, парагриппа крупного рогатого скота. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) основана на адсорбции антигена на поверхности эритроцитов, которые затем агглютинируются сывороткой, содержащей соответствующие антитела.
Преципитины и реакция преципитации
Преципитинами - антитела, которые при контакте со специфическим растворимым антигеном (преципитиногеном) вызывают образование осадка (преципитата). Эта реакция отличается чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. Можно обнаружить антиген, разведенный в несколько миллионов раз.
Преципитиногенами могут быть белки любого происхождения. Реакцию преципитации широко используют при диагностике сибирской язвы. Проводят массовые исследования кожевенного и мехового сырья, исследуют экстракты из органов животных, причем пригоден даже разложившийся материал. Возможность его автоклавирования обеспечивает безопасность работы. В последние годы в широких масштабах применяют реакцию диффузионной преципитации в агаровом геле (диагностика бешенства, вирусной диареи крупного рогатого скота, классической чумы свиней, инфекционной анемии лошадей).
Лизины и реакция связывания комплемента
Лизинами - антитела, способные растворять (лизировать) микробные клетки или другие клеточные элементы. Бактериолизины лизируют бактерийные клетки, гемолизины растворяют чужеродные эритроциты. Эти специфические антитела, содержащиеся в иммунных сыворотках, проявляют свое действие только при участии дополнительного фактора - комплемента.
Комплемент - неспецифическое защитное вещество, которое легко адсорбируется комплексом антиген — антитело и имеется в любой свежей сыворотке, как нормальной, так и иммунной. Лизины термостабильны, а комплемент разрушается при нагревании сывороток. Сыворотку, комплемент которой разрушен нагреванием, называют инактивированной.
Для выявления специфических бактериолизинов в сыворотке крови используют реакцию связывания комплемента (РСК). Она имеет большое значение в диагностике бруцеллеза, сапа, контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота и многих других болезней.
В настоящее время в лабораторную практику вошла реакция длительного связывания комплемента (РДСК), обеспечивающая более точные результаты исследования.
Антитоксины — антитела, возникающие вследствие поступления в организм токсинов или анатоксинов и оказывающие специфическое нейтрализующее действие на эти яды. Иммунные сыворотки, содержащие такие антитела, называют антитоксическими. В ветеринарной практике их используют с целью профилактики и для лечения при столбняке, ботулизме.
Опсонины — антитела, способствующие фагоцитозу. Активными фагоцитами являются нейтрофильные лейкоциты, эозинофилы, моноциты, гистиоциты и клетки ретикулоэндотелиальной системы. Действие опсонинов изменяет электрический потенциал поверхности бактерийных клеток и делает их более доступными для захвата и переваривания фагоцитами. Опсонины обнаруживают и в иммунных и в нормальных сыворотках крови. Их содержание в крови неиммунных животных незначительно.
Отмытые от плазмы лейкоциты крови теряют способность к фагоцитозу. Добавление иммунной сыворотки восстанавливает это свойство, причем интенсивность возобновленного фагоцитоза зависит от содержания антител в добавленной сыворотке. Это позволяет сравнивать активность сывороток и даже диагностировать некоторые болезни с помощью опсоно-фагоцитарной реакции.
Для проведения серологических реакций необходимо получить кровь.
Техника взятия крови у животных разных видов. Животных фиксируют, подготавливают место прокола: выстригают шерсть (у птиц выщипывают перья, у свиней кончик хвоста обмывают теплой водой с мылом и высушивают чистым полотенцем), дезинфицируют 70%-м этиловым спиртом, 5 % спиртовым раствором йода или 3%-м раствором фенола.
Иглы (рис. 1) перед началом работы тщательно чистят мандреном, промывают водой из спринцовок и стерилизуют кипячением в течение 30 мин. Для каждого животного используют отдельную стерильную иглу.
Рис. 1. Иглы:
инъекционные: 1 — типа Рекорд; 2 —для аллергического исследования;
пункционные: 3 — для спинномозговой пункции; 4— Кассирского для взятия костного мозга;
для взятия крови: 5— И-5Г; 6— И-52; 7—Каспера; 8 — Дюфо; 9— Боброва; 10 — Сайковича; 11 — Ананьева
Для серологических исследований у животных берут 8-10 мл крови, у птиц -2-3мл (для исследования на лейкоз —3-4 мл, при этом заранее вносят в пробирки 16 ЕД гепарина в 0,2 мл физиологического раствора).
Кровь берут из яремной вены, желательно утром до кормления животных. Большим пальцем или с помощью жгута пережимают яремную вену. При хорошем наполнении вены прокалывают иглой кожу и стенку вены под углом 45-50° по направлению к голове. К свободному концу иглы подставляют пробирку или надевают резиновую трубку, конец которой заранее опускают в пробирку. Кровь должна стекать струей по стенке пробирки. Взятая по каплям и вспененная кровь скорее гемолизируется и часто бывает непригодной для исследования.
Если после прокола кожи кровь не течет, значит, игла еще не попала в вену или прошла вену насквозь. Необходимо уточнить место нахождения конца иглы и спокойно исправить ошибку. Если кровь вытекает каплями, нужно дополнительно сдавить вену пальцем или сильнее затянуть жгут.
При взятии крови у коров из хвостовой вены, необходимо взять рукой хвост животного в области средней трети и медленно поднимать вверх. Место, где предполагается произвести прокол, продезинфицировать спиртом или 5% раствором йода. Ввести иглу в вену перпендикулярно линии хвоста. Кровь берут в средней трети тела 2-5 хвостовых позвонков, находящейся на линии, идущей вдоль хвоста и делящей его на 2 симметричные части (рис.2.).
Вставить заранее подготовленную вакуумную пробирку в иглодержатель до упора (при этом указательным и средним пальцем придерживать выступы иглодержателя, а большим пальцем проталкивать пробирку к игле). Игла прокалывает резиновую мембрану и резиновую пробку крышки пробирки. Образуется единый канал между пробиркой с вакуумом и полостью вены.
Таким образом, кровь из вены попадает непосредственно в герметично закупоренную пробирку. Кровь появится на стыке пробки и задней части иглы. В случае отсутствия тока крови в пробирку (игла прошла вену насквозь) вернуть острие иглы в полость вены (не вынимая иглы), при этом кровь начнет поступать в пробирку.
При необходимости взятия крови в несколько пробирок – не вынимая иглы из вены, осторожно поменять наполненную кровью пробирку на следующую.
Когда взятие проб крови закончено, удалить пробирку из держателя, затем вынуть комплекс иглодержатель из вены. Снять иглу с держателя и утилизировать иглу. На этикетку нанести порядковый номер контейнера и номер животного.
Овец прогоняют через раскол, рядом с которым выкапывают траншею глубиной около 1 м. Ветеринарный специалист находится в этой траншее, и к нему по очереди подводят овец. Иногда вместо траншеи делают специальный длинный стол высотой 60...90 см. Овец через раскол и трапы загоняют на стол и фиксируют, ветеринарный врач стоит рядом и берет кровь (яремную вену у овец легко пережать пальцем).
Свиней предварительно фиксируют за верхнюю челюсть с помощью веревочной петли и пробы крови берут из уха или хвоста путем прокола или надреза сосудов. На практике чаще всего отрезают скальпелем кончик хвоста. Также применяется методика взятия крови с помощью вакуумных систем (рис.3.) из хвостовой вены, глазного синуса, молочной вены. Применяют и такой способ: у зафиксированного животного хвост поворачивают левой рукой так, чтобы вентральная его поверхность была обращена направо и кверху. На границе средней и нижней трети хвоста строго посередине остроконечным скальпелем прокалывают все мягкие ткани до позвоночника. При этом рассекают кожу, подкожную клетчатку, мышцы и вентральную артерию поперек. После прокола тканей хвосту придают естественное положение и приподнимают нижнюю его треть, для того чтобы операционная рана была открыта. Кровь выделяется равномерной струей. Взяв нужное количество крови, место прокола смазывают 5%-м спиртовым раствором йода и хвост отпускают. В результате сокращения мышц хвоста просвет прокола закрывается и кровотечение в течение 3...5 мин полностью прекращается.
а) из хвоста б) из глазного синуса
Рис. 3. Взятие крови у свиньи с помощью вакуумной системы взятия крови
Каждую пробирку с кровью закрывают пробкой. На этикетке указывают порядковый номер пробы, кличку или индивидуальный номер животного, фамилию владельца. Пробирки ставят в штатив или связывают по 10 шт. и помещают в ящик.
